荧光的应用之全内反射荧光显微镜（TIRFM）

　　TIRFM（Total Internal Reflection Fluorescence Microscope），全内反射荧光显微镜，利用光从高折射率的介质进入较低折射率的介质时，如果入射角足够大时则光全部被反射而不发生折射，但是在两种介质的界面会产生衰逝波可以激发近界面100nm范围内的荧光的原理来实现对物体表面的观察。可通过常规荧光显微镜的照明器或特殊照明器送入激发光，并对激光的入射角度进行控制，采用瞬间场激发方法以避免激发光进入探测器，在玻璃和水界面的激发光产生全内反射实现的。因为激发光呈指数衰减的特性，只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，大大降低了背景光噪声干扰观测标的，故此项技术广泛应用于细胞表面物质的动态观察。

全内反射荧光显微镜 (TIRFM)示意图

①样品 ②损耗波范围 ③盖玻片 ④浸镜油 ⑤目标 ⑥发射光束（信号） ⑦激发光束

　　为了实现全内反射，需要大的入射角，例如玻璃-水界面的入射角要大于61度。这可以通过棱镜(prism)实现，称为棱镜型TIRFM（prism-based TIRFM），也可通过高数值孔径的物镜实现，此时称为物镜型TIRFM（objective-type TIRFM）。现在商品化的全内反射荧光显微镜一般都是物镜类型的，速度快，精度高。

　　全内反射荧光显微镜由于能实现物体表面非常薄范围内（小于100nm）荧光观察，故在某些生物领域得到广泛应用。如以下等应用：

细胞表面图象的观察：细胞膜表面结构、细胞表层的接触、膜表面动力学/蛋白质定位。

单分子观察及其操作：肌球蛋白、肌动蛋白与Cy3标记ATP。

细胞膜表面运动：如泡吞、泡吐现象，泡外分泌现象。 

细胞膜钙火花现象的观察，离子通道监视。

分子马达研究：旋转的马达、细胞骨架蛋白、聚合体、G蛋白、环状蛋白、核苷酸马达。

　　除了在生物领域外，在化学领域等对于化学分子结构观察中也有很好的应用。