多色荧光成像在生命科学领域是非常常见的一种研究手段。各种不同颜色的荧光探针如DAPI（蓝色），GFP（绿色），mcherry（红色），YFP（黄色）等与特定的蛋白结合，分别在不同的波长被激发，发射出不同颜色的荧光，从而帮助我们区分不同类型细胞或蛋白，研究它们的相互作用等。
传统的多色荧光成像是通过控制滤色片转盘切换不同的通道，分别拍摄荧光图片，然后在软件中将它们合成一张多色荧光图像（图 1）。但是机械部件的切换通常比较慢，尤其是对于活细胞成像来说，损失了大量时间，不能进行高速采集，无法捕捉到一些非常迅速的动态事件。
图1 多色荧光成像示意
如何提高多色荧光成像的效率呢？本期显微技术专题我们就给大家介绍多色荧光成像的一件神器——分光器。
首先，我们来聊聊什么是分光器。
什么是分光器？
谈到分光器，大家应该并不陌生，它就是一个将一束光分成2束或多束的光学装置。最常见形状是一个立方体（Cube）（图 2A-C），由两个三角玻璃棱镜胶合在一起组成，通过调整粘合层的厚度，从一面入射的光一半可以通过棱镜继续传输，另一半被反射（图 2A）。另一种常见的形态是分光镜，一片玻璃或塑料片的一面有非常薄的金属涂层，厚度刚好可以实现50%的光透射，50%的光被反射（图 2D）。我们常用的二向色镜就是这种类型，只不过是用特殊的二向色光学涂层代替金属涂层，可以将光束分成不同波长的两束光。涂层的材料不同，反射/透射光的比例也不同。和cube相比，分光镜可以允许更强的入射光，但cube更耐用更易操作。
图2 分光器原理 （A）分光器原理，1 为入射光，2 为透射光，3 为反射光。（B）不同规格分光器大小示意。（C）（D）分光器cube和分光镜。
为什么要用分光器？
了解了分光器的原理，下面我们来谈谈它如何让我们的实验变得简单高效~
文章开头我们就说过传统的切换通道进行多色荧光成像的方法比较费时（图 3a,b），而分光器就可以解决这个问题。试想一下，通道切换的步骤被省去了（图 3c），通过二向色镜和不同波长滤色片的结合，可以一次性同时对所有的通道成像！这不但大大节省了实验时间，更适合长时间活细胞成像和高速成像。而且如果需要，还能实现荧光和明场同时成像，简直一举多得！
图3 多色荧光成像的几种方案。（a）切换不同的 cube，速度最慢（b）直接切换滤色片，速度比（a）稍快（c）使用分光器用两台相机同时成像，速度最快。
那么，究竟如何将分光器用于多色荧光同步成像呢？有两种方法：
- 只用一台相机成像，由视野的不同区域对单个通道成像
- 多台相机同时成像，每台相机对一个通道成像
下面我们就分别来介绍一下这两种方法：
单相机同步多色成像
分光器连接在显微镜和相机之间，将入射光按不同的波长分成几束，并投射到相机视野的不同区域进行成像，每个区域只对一种波长成像（图 3）。如图 4 所示，在一个2通道的分光器中，从样品来的发射光通过二向色镜被分成两束波长不同的光（一般是长通短反），再通过几组棱镜的反射，投射到同一台相机芯片的左右两边。这样相机的左右各一半视野就分别显示同一样品不同通道的荧光图像。通过软件合成就可以得到我们想要的多色荧光图像。
图3 双通道分光器实现双色荧光同步成像（Prime 95B）
通过增加二向色镜和棱镜的数量，就可以实现三通道甚至四通道的单相机多色成像。图 5 向大家展示了 Carin Research 公司生产的双通道分光器 OptoSplit II，三通道分光器 OptoSplit III 和四通道分光器 MultiSplit V2 用于单相机多色成像的效果。
图5 双通道（上），三通道（中）和四通道（下）分光器效果示意
这种方案不但省时省力，而且节省成本。许多高端的成像应用如 FRET，钙离子/电压成像，转盘共聚焦和 TIRF 等都可以使用这种方案。以 TIRF 为例（图 6），基于全内反射原理，样品被照亮的部分很小（~100nm），与宽场荧光相比，杂散光更少，信噪比更好，特别适用于研究样品靠近表面的区域。再加上TIRF曝光时间短、焦平面单一，常用于动态过程成像。分光器的加入可以使得多通道 TIRF 的速度更快（图 6C），能够响应非常快速的动态过程。
图6 TIRF成像示意。（A）TIRF原理：在单个细胞中，由盖玻片反射的光产生的倏逝场会激发离盖玻片最近的一些荧光分子（绿色）（B）TIRF成像光路（C）双色同步TIRF成像
但是，使用单相机的一个最主要的问题就是有效成像视野被大大缩小了，从图5中大家也不难看出，双通道同步成像的有效视野只有相机正常视野的1/2，通道越多视野越小，四通道就只有1/4。如果你想要拍摄比较大的样品，就要在通道切换节省的时间和采集图像增加的时间之中做个权衡了。这时候你有两个选择来解决这个冲突：第一个——选择一个大视野的相机！如 Teledyne Photometrics 29mm 对角线视野 sCMOS Kinetix，四通道成像单个有效视野依然可以达到对角线 15mm，能够满足大部分样品的要求（图 7）。
图7 Kinetix 四通道多色同步成像示意
第二个方法更加简单粗暴——增加相机数量！
多相机同步多色成像
在单相机的方案中，我们需要把一台相机的视野分成几个等分给不同的通道，那么直接用另外的相机来对不同通道成像不就好了吗？如图 8 所示，分光器将入射光分成两束，透射光投射到一台相机，反射光投射到另一台相机进行成像。这就是 TwinCam 的工作原理：两台相同的相机同时对同一样品成像，每台相机只负责一个通道。还有同时使用四台相机的 MultiCam，在 TwinCam 的基础上再增加一个二向色镜，就可以进行四通道成像了。这种方案的好处是既能实现多色同时成像，又不会损失视野，当然价格会相对比较高。
图8 TwinCam 和 MultiCam（Carin Research）原理示意（搭配 Prime 95B）
总的来说，分光器的使用不但改进了现有的多色荧光技术，也为开发一些新的成像技术提供了可能。作为连接显微镜和相机的桥梁，它能帮助研究人员们更好的控制光，大大增加了实验的灵活性。
