拍免疫荧光或者荧光转染的时候,一定会遇到不同颜色荧光照片合并与分割,以及荧光和明场照片的合并问题。
虽然大部分情况下,拍照软件会完成这一工作,但如果想对某一颜色的图片进行修改,然后再合并,或者提取某一个通道的照片,这时候就需要ImageJ了。
ImageJ中的这一功能较为基础,不需要插件,作为基础功能篇的第一篇,主要介绍怎么利用ImageJ对荧光照片合并、分割,以及荧光与明场之间合并。
一、不同荧光照片合并、分割
(1)合并
1、打开待合并的图像
三张不同颜色的荧光图像
2、合并不同颜色通道(Image-Color-Merge Channels)
弹出Merge Channels界面:
总共有7个颜色通道,每个颜色选择对应的照片,点击OK。出现合并后的图像(Composite)。
但这时候的合并图像只是三个8-bit的Stacks,如果要保存的话需要把图像转换为RGB模式。
左右调节工具条,发现左上角的颜色信息会变,但是图片依然是合并后图像
Tips:如果想要更改某一颜色通道,可以使用Channels Tool(Image-Color-Channels Tool),选择不同通道后,对单一通道进行修改,不影响其他通道。
选择不同Channel,可以呈现不同颜色
3、生成RGB的合并图像(Image-Color-Stack to RGB)
生成一张命名为Composite的RGB图像:
命名为Composite的RGB图像
注意:这里一定要Stack to RGB,否则保存后的图片并不是Merge后的状态。
4、保存图片(File-Save)
(2)分割
1、打开一张RGB图像
2、将RGB图像转换为Composite图像(Image-Color-Make Composite)
这时候三种颜色通道都已经分离出来了。这一步是为了后面能直接分割出三个带有伪彩的通道。如果直接Split Channels,也会得到三个通道,但是没有伪彩。
(3)分离不同颜色通道的图片(Image-Color-Split Channels)
(4)分别保存图像(File-Save)
二、荧光与明场之间合并
做siRNA、慢病毒等转染实验时,需要统计细胞的转染效率。同一视野下,分别拍摄荧光和明场的照片,这时候就需要将荧光和明场照片合并,易于计算带有荧光标记的细胞。
1、打开荧光和明场图像
2、合并不同颜色通道(Image-Color-Merge Channels)
与荧光照片合并的唯一不同是:明场照片选择gray通道:
Tips:如果荧光较弱,可以单独对荧光照片增加亮度和对比度(Image -> Adjust -> Brightness/Contrast)。
3、生成RGB的合并图像(Image-Color-Stack to RGB)
4、保存图片(File-Save)
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