我们上几期的真相系列文章讨论了信噪比(做成像的你不能不了解的真相3 - 信噪比1；做成像的你不能不了解的真相3 - 信噪比2) 和灰度值与电子数的换算（增益Gain, 灰度值与电子数-做成像的你不能不了解的真相4）。本期我们以Image J 为例，讨论一下怎样使用图像分析软件，对图像的信噪比进行定量分析。
理论上说，信噪比是对每个像素亮度变化的统计分析。即使在相同条件下拍照，由于噪声的存在，同一像素的亮度是变化的。测量信噪比，需要在同样条件下拍摄多张图像，然后对感兴趣的像素在这一系列图像中的亮度做统计分析: 这些亮度的平均值为信号，标准方差为噪声。
然而，现实中我们通常只有一张图像，以上的分析很难实现。以下我们讨论只有一张图像时，简化的信噪比分析方法。
01感兴趣区域(ROI) 的直方图统计分析
当感兴趣区域(ROI)内的信号均匀时，这个区域内的像素亮度的平均值代表信号，标准方差代表噪声。当这个区域的像素有足够数量时，比如100个或以上，即使只有一张图像，分析的结果和上述使用多张图像的分析结果相同。
例1
测量一台相机的偏置 （offset）和读出噪声（read noise）。我们把显微镜的光设置为全部到目镜，或者盖上相机的镜头盖，用很短的曝光时间(比如1ms)，这张图像中仅含偏置offset和读出噪声 read noise，没有信号，称为Bias图像。
显然，此时满足以上我们说的分析区域的信号均匀的条件。那么，只要测量这张图像上所有像素的亮度平均值和标准偏差，我们就能得到想要的结果了。
打开Image J， Analyze –> Histogram (直方图)。 这时我们看到的Histogram 窗口中 Mean 就是信号平均值(此时为offset)， Std.Dev 就是噪声(此时为读出噪声)。 当然，这里的单位还是灰度值(ADU)。我们需要知道此时的增益 (Gain)， 就能把读出噪声换算成以电子数为单位了。Offset 通常习惯就用ADU的值。 此例中，相机Gain = 0.21e-/ADU，因此：
读出噪声 = Std.Dev * Gain = 8.279 * 0.21 = 1.74 e-.
分析以下图像黄色的感兴趣区域的信噪比。我们已知这个区域亮度是均匀的，首先使用Image J的ROI工具定义该区域。ROI可以是矩形，圆形，任意多边形，甚至可以是一条线段。
这个例子使用矩形比较合适。定义好ROI后，使用以上描述的方法，可以得到mean为586，Std.Dev 为47.8。
已知相机的offset为103，以上ROI区域信噪比为：(587-103) / 47.8 = 10.12
注意，因为是比值，没有换算为电子数，对结果没有影响。
那这个区域信号的电子数是多少呢？因为Gain = 0.21e-/ADU，所以：
信号 = (587-103)*0.21 = 101.6 e-
之前说过，当图像工作在光子信号噪声限制区(Shot Noise Limited)时，信噪比等于信号电子数的平方根，即
和统计分析得到的结果符合，是不是很神奇?
再换个角度验证这个方法的正确性。上面的图像我们实际拍摄了100帧。同样使用Image J，我们随机定义黄色区域内的某一个像素为ROI(只有一个像素的ROI)，然后用Image >Stacks> Plot Z-axis Profiles。
得到100张图像中这个像素的亮度数据如下。
点击这个曲线图下方的More-Copy All Date， 可以把数据复制到excel做统计分析。
以下是随机选取的4个点的结果。 可见，对亮度均匀的ROI， 使用多张图法和单张图法得到的结果是一致的。
以上方法，大家仔细想想就知道，需要ROI内包含一定数量的像素。像素个数越多，得到的结果越准确。给个参考值，大概100个像素就很好了。
强调一下，这种方法适合ROI亮度均匀的情况。当分析区域的信号不均匀时，比如样品结构变化，计算出的标准方差不仅包含噪声，也包含样品结构信息，这时就不能使用上述方法了。
02线形强度(Line Profile)统计分析
如果把线(line)也作为一种特殊的ROI， 这个方法其实和上面的方法没有本质区别。我们知道，有些实际的图像，感兴趣的区域可能是线形的。比如下图，想分析线形结构的信噪比，如黄色曲线标出的部分。
Image J 的ROI定义工具可以定义直线，折线或自由曲线，如下图:
定义好线后，选 Analyze >Plot Profile
我们就能得到下面的亮度曲线图。点这个图左下方的List，还能得到右边的数据表。
在Plot 曲线窗口，选More> 同样可以把这些数据复制粘贴到excel做统计分析，得到这条曲线下的像素点的mean和Std.dev 值， 从而计算出SNR。
和ROI直方图方法类似，这个分析也要求线段有一定长度，越长测量结果的统计意义越好。
在实际评价图像时，我们也经常使用这个Line Profile工具， 快速对图像的信噪比有个大致的了解。如下图，从左到右，图像信噪比提高。相应的Line Profile表现为高频成分减小。
或者，做相机灵敏度对比：中间的Line Profile曲线，清楚的体现了左右两种相机的灵敏度差别。
03通过测量小区域的平均亮度，使用理论公式计算
如果要分析的对象，均匀的ROI或较长的Line都比较难定义，如下面图像上亮的块状或点状区域，这时可以先测量小的ROI的平均亮度，换算为电子数，再通过理论信噪比公式来计算。
关于理论信噪比公式，这里我们来复习一下:
同样，使用ROI工具，定义ROI。
这次，我们使用Analyze > Measure 工具
每次测量可以得到右边窗口的一行结果。可以多次对多个区域测量。
这次我们只使用mean值，因为此时ROI 太小，Std.Dev没有准确的统计意义。以上得到的mean的单位为ADU，乘以Gain后换算为电子数。如果强度足够大(比如对sCMOS相机>50e-)，能肯定相机在光子信号限制区域(因为读出噪声<2e-)， 直接计算平方根就得到SNR了。注意，计算时要先减去offset。
如果信号比较弱，在Read Noise 限制区或过度区，比如我们前面例子的相机，如果信号在10e- 以下，最好把读出噪声计算在内，用我们用过的完全的公式:
当然，这个方法有一定误差，因为使用的样本点较少，得到的平均值精度受影响。所以在允许的情况下，应该尽量把ROI定义大一些。
以上我们讨论了基本的信噪比分析方法。希望能对你的工作有帮助。到此我们的不能不了解的真相系列文章也告一段落了。请继续关注我们后续的相机技术文章。
