荧光显微镜和结构光照明
荧光显微镜和阿贝衍射极限
荧光显微镜的提出提高了显微镜成像的对比度，能够利用荧光染料的特异性，把关注的对象染色从而单独观察出来。除此之外，对比度的提高还和背景噪声有关，为了降低背景噪声我们希望能够只拍摄薄薄的一层。一种可行的方法是进行非常薄的切片，但切片方法如冷冻限制了活细胞成像。因此另一种思路就是只照亮薄薄的一层荧光分子，让光从波片左右横着打过去而不是从波片上方打过去，且利用一些特殊的性质使这个光非常薄，被称为“光片”（optics section或者optics slice）。这也是很大一块领域。
TIRF
另一种方法是利用隐逝波，进行全内反射照明的TIRF(total internal reflection fluorescence) 方法。我们都知道光从空气或者油或者水等介质进入盖玻片时，如果入射角大于临界角，会发生全反射，不会有光进入盖玻片而是全部被反射掉。但在全反射发生的时候，按照波动光学的观点，其实折射面是有一个能量场存在的：
这个能量场就是隐逝波或者说隐逝场（总之是evanescent wave，中文翻译有好几种。这个能量场的式子是：
只看x方向可以发现是个正弦波，只看z方向可以发现强度随z轴坐标指数级衰减。这个指数级衰减就是TIRF用到的点：它只会照亮z轴上非常薄的一层，比光的波长还要薄。因此如果光全反射地打在载玻片上，用隐逝波去激发荧光分子，就只会激发很薄的一层，就避免了厚度带来的噪声。
超分辨率荧光显微镜
由于光的波动性质，光学显微镜的最高分辨率为0.61λ/NA ，NA为物镜的数值孔径，这个极限被称为阿贝衍射极限。这限制住了直接观察样本的所有光学显微镜的分辨率，当时只有转向电镜等原理完全不同的显微镜才能突破。不过很快就提出了三种在光学显微镜上突破阿贝衍射极限的方法，分别是SIM（结构光照明），STED（受激发射损耗），SMLM（单分子激发）。
SIM
SIM使用多种非均匀的光照（如不同方向的正弦条纹）去照射样本并拍摄多张照片，再用数学方法从多张照片中反解出真正的高分辨率照片。线性的SIM由于光照pattern的精度也受光的波长限制，最终最多提高两倍的分辨率。另外也有非线性的方法，比如使用特殊的荧光染料，其激发曲线是非线性的，那么不考虑噪声，理论上可以提高分辨率到无限倍。
STED
STED首先是一个点扫描的方法，是用一根极细的光柱去照亮一小块区域；把所有照亮的小区域的照片合起来就是整个样本的照片。因此阿贝衍射极限在这里表现为光柱的尺寸是有限的，突破阿贝衍射极限就是要得到更细的光柱。具体的方法是用一束圆环形（多拿滋形）的光（红色）去“耗尽”激发光（绿色），使得真正的激发光更细。这圈耗尽光是用特殊的圆形波片得到的，在波片角度为x的位置光通过后波长减少x。
SMLM
SMLM认为阿贝衍射极限带来的影响是多个荧光分子挨在一起的时候无法被区分开，对拍摄图像的反卷积成了一个欠定的问题。因此SMLM使用了特殊的荧光染料和照明光，使得单个荧光分子被激发是一个比较低概率的事件，因此整个样本中在一次拍照时被激发（从而能被拍摄到）的荧光分子是稀疏的，也就可以进行反卷积。将多次反卷积得到的荧光分子位置信息加在一起，只要拍摄张数足够多，就可以得到整个样本的图像。
理论上，后面两种方法也可以得到无限倍的高分辨率图像。但是存在成像速度慢的问题。SIM成像速度较快，但是目前科学界似乎都更相信直接拍摄出来的能观察到的图像，而不是SIM这样经过了计算处理的图像。
在荧光显微镜成像领域，成像深度/光毒性（光照射太久，光照太强会使荧光分子失活以及影响样本活性）/空间分辨率/时间分辨率（也就是成像速度）上互相限制，传统的方法都是在寻找一个tradeoff或者把某一个做到极限。（所以很多深度学习的方法开始进来卷）
结构光照明
前面提到了SIM是结构光照明荧光显微镜（用于超分辨率），不过其实结构光照明的概念在更早之前就有提出。再之后有两条不同的路线，一条目的是提升分辨率，一条是去除背景光（提升对比度其实也变相提高了分辨率）得到“光片”。
SIM for super resolution
这条路线是前面讲的SIM，为了提高分辨率，突破硬件的阿贝极限限制。
最初的提出是1966年“Optical Systems with Resolving Powers Exceeding the Classical Limit”。阿贝衍射理论认为光学系统的带宽是有限的，所以分辨率是有极限的；这篇文章认为只是传输信息的自由度是有限的，自由度=拍摄面积x空间频率带宽x2（两个偏振方向）x 时间频率的自由度。因此降低拍摄面积，降低偏振方向，降低时间频率的带宽，都可以拓展空间频率带宽，也就是提升分辨率。使用非均匀的光照（且照明pattern之间是不相关的）可以改变自由度，这时候提出的就是在光路加光栅，用条纹做频域平移。
这篇文章是纯理论的没做实验，只提升了一个方向上的分辨率，并且不是得到多张照片之后用计算的方法解高分辨率照片，而是完全是用光路设计把多个图像合起来（非常复杂我看不懂），这时候也没有荧光染色。
之后的发展过程：
1.有了荧光染色，最开始还是用光栅去得到条纹照明，缺点是旋转和相位移动的抖动带来噪声，而且慢。这个光学设置大概长这样：
2.用驻波双光束衍射，相位的移动可以用双光束的相位差改变（用压电传感器做稳定的微小位移），但是旋转仍然很慢。驻波照明比较普遍使用的光路：
红色框起来的部分把光分了一半，直接在CMOS上成像pattern。
不过往上的光路和往右的光路不能做到完全相同，因此右边采集到的pattern并不是直接用来作为样本照明pattern来求解的，是作为一个参考，用来矫正系统的相位偏移。论文还提到，实际上条纹间距（190nm）小于系统分辨率（260nm）了，因此在这个装置中右边的条纹是被放大了10倍，才能被比较准确地采集到。
3.用SLM来分光，也加入了偏振调制，速度和精度都提高。在上一篇博文大概写了一下。集大成者是“Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination”这篇论文，综合了TIRF，频域滤光，偏振调制，SLM分光，在补充材料里面讲得非常清楚。
另一种不太主流的方式是投影，大概在SLM出现的阶段才开始出现，优势是装置简单价格便宜，精度是比较差的（原因：1.衍射斑点，2.pattern过透镜其实是经过了低通滤波所以比较糊）。
在发展过程中出现过条纹，散斑，网格等等各种pattern。条纹的优势是更接近传输的频率极限，因此能达到2倍的分辨率提升，高频部分更突出，噪声更小。除此之外，周期性的条纹可以通过得到的照片计算估计，精确度很高。而其他pattern都需要在现实的装置中去获取，即使经过仔细的校准和高质量的光学计算，由样品引起的畸变仍可能会降低结果。在数学上，条纹也更容易在频域求解，只要拍摄9张就好！
SIM for optic section
这条线是为了消除背景噪声，得到光学切片，并不真正提高分辨率。
原理是如下图，离薄的焦平面越远的背景噪声在被照明的时候是越”糊”的，因此用不同的patten拍摄多张照片，然后用每个像素在所有照片中的max-min就可以近似得到去除背景噪声的切片了。
这条线基本上是两个挖掘的方向：
1.更复杂的算法来替代粗略的max-min；
2.寻找不同的pattern，比如pattern在稀疏和密集之间其实有个trade-off，越稀疏越能得到真实的切片，缺点是需要越多张数的照片。
pattern上有使用散斑也有网格也有条纹，这一大类方法也叫做结构光照明。
blind SIM
在提升分辨率的SIM发展到后期时，为了避免在更精确地得到pattern上卷，提出了干脆不要估计pattern好了。假设pattern也是未知的，只有一定的约束（比如稀疏性，连续性等等），用算法把pattern和原图一起解出来。在这类方法里面随机散斑可以作为pattern。
也有根本不把pattern解出来的，只要拍足够多张然后取max就行，有点类似单分子激发的思路：
之后发展出另一大类：散斑pattern不变，但是在不同照片中散斑往某个方向移动一小段距离，这段距离是已知的。需要的拍照数量更少一些。
blind SIM的散斑照明的缺点是拍照张数和求解精确度之间的矛盾，张数小的时候其实需要先验约束条件，随着张数增加对先验的依赖减小，求解矩阵的条件数减小，求解更加精确。一般来说，最少还是需要拍摄几十张图片的。
除此之外，“某个方向移动一小段距离”这一点也需要在实际光路中去测量，会带来误差。
