Annotated LncRNA的实时定量PCR引物设计教程

LncRNA设计原则

LncRNA的引物设计跟mRNA的引物设计类似，都遵循以下规则：

1.引物应在核酸系列保守区内设计并具有特异性。
2.扩增产物长度在 80-150bp。最长不要超过 300bp。
3.产物不能形成二级结构(自由能小于 58.61KJ/mol)。
4.引物长度:一般在 17-25 碱基之间,上下游引物不宜相差太大。
5.引物自身不能有连续 4 个碱基的互补,避免形成发卡结构。

 

LncRNA引物设计

我们通过在线工具Primer3Plus(http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)来设计引物，下图为Primer3Plus的网页界面：

这里我们首先需要设置General Settings,需要设置的参数:

Procuct Size Ranges:100-150bp

Primer Size:18-25bp

Primer Tm:58-60

Primer GC:45%-55%

设置完成后点击Load Settings,然后开始输入LncRNA的fasta序列，我们输入一个annotated的LncRNA序列：

>ENST00000487094.1
GAGCAGGGAGGCTGCGGTGGATCAGCTGCCTGCTGTCTCTGACTGGAAGCCACTACCTTTAGGGCAGGGACTCCGACTACTTCACTCGCCACCGGATCATCTGGGTTTTGAAGAAACCAAGATGCCTTTCATTAATTCTTCCAACTAAATTAATGGAGTCACTGCATCTCGAACACCATTAGCAGAGCAGAGACAAGAGTTTTGGCTGGAAAAGGGTTCCTGCTTTTTTATCTTCTTCATTTTCTCTTGCCACCACCATGTAAGAAGTGCCTTTCACCTCCCACGATGATCCTGAGGTCTCCCCAGCCATGTGGAACTATGTGCACAATCATTATCACTGATGTACCTGTGTCTTCAGCCTGTTTGACTACACTGGGGTGAGGACGTTGTGGAACAGATGGATTATTATCTACCTGGGCTCACACAGCTAGGAGGTGATAAAGGAAAGAAGCAGCATGTAGCCATTGGACCCAACCCCTCAGCCACTGTAGAGCTTGAGAGAGCTGGATCTCTCCAAGTTATATCCAGCTTTTTAATTATCTGACAAAGGAGAACATGAAGGATGAATTCCATCATCACCAAAAAGTCATAGTGATATTAACACATGCCCTGATAACCTGAGAAAACTGCTGTGAAACCAGAGAACAGTTTGATAATGAGCCTGGGACATATACAAGAAAACCTGAGCTATAGAGTGAGTGTCTGCAAAGGCCGAGAGGGCTCCCACTATGTTCATTCTCCTGGAGGTTGCTTTTATCCAACTCACAGTTGCTTCTTTTGCTCTTTATGGAGGTGTTTGGAAATCTTGAAATTCTTAAGGTTGCTTTGACCTTCTTAGATGAAA

 然后点击绿色的Pick Primers,就能得到以下的引物序列：

 这里一共出来了5对引物，我们随便选择一条LncRNA的引物，这里我们选择第一条引物：

TCCCACGATGATCCTGAGGT

TGTTCCACAACGTCCTCACC

 

LncRNA引物特异性分析

网页工具：NCBI Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)

1.将上下游引物复制过去 

2.勾选Standard databases(nr etc.):选项

3.物种选择human (taxid:9606)

4.勾选Somewhat similar sequence(blastn)选项 

5.点击BLAST

 然后得到以下结果：

 发现与AC011294.3匹配度为100%，与其他的最多为52%，而我们的LncRNA注释为AC011294.3，所以引物设计没有问题！