初学生信——Base-calling（碱基判读技术）

参考：https://zhuanlan.zhihu.com/p/340449764

Base calling是一种算法（软件）：可以从row images（原始图像）里通过计算机视觉的方式识别碱基类型（DNA序列），将结果写到cal文件里，最后帮助我们生成测序报告和FastQ数据。

 

Base Flourescence：荧光

signal detection：信号检测

每一次保存图像后，算法软件会找到每一个DNB (DNA纳米球) ，并将数据记录在案。因为每一个芯片上都有数以亿计的DNB，所以我们也会通过特殊的结构设计，让算法软件可以更容易的找到并识别每一个DNB。

一旦找到并识别出DNB，接下来我们就可以提取图像光强（灰度值）。这里我们采用的是4荧光系统，也就是ATCG四种碱基会表现出不同的激发反应，会得到不同的灰度值。这里，我们可以看到在第三张表格里，A对应的图像位置灰度值最高，所以可以判定此处的碱基是A。

 

上图是一张简化示意图，每一个正方形的区域都是一个视野FOV(Field of View)，也就是说每次拍照后，摄像机只能看到这么大的区域，当然通过移动，可以随后通过多FOV拼接技术，还原整个芯片的大视野。这里，四种荧光物质会被激光激发，如果是A则会产生绿光，如果是C会得到红光，如果是G会得到蓝光，如果是T则会得到黄光。

 

图像配准和灰度值提取

首先我们会找到一些标记点（crosspoints），然后对每一个小块的4幅图像进行配准（registration），最后对每一个DNB位置上的灰度值进行读取。理想状态下，相应颜色碱基的灰度值最大，其他非相应碱基的颜色最好为0。然而实际上无法做到。会存在crosstalk现象，也就是其他非相应碱基的荧光物质也会或多或少地被激发，对实际的测量会造成影响。