01Megahit基因组装

1、背景

每一个物种的参考基因组序列（reference genome）的产生都要先通过测序的方法，获得基因组的测序读段（reads），然后再进行从头拼接或组装（英文名称为do novo genome assembly），最后还原测序物种的各条染色体的序列，即ATGC四种碱基的排列顺序。

之所以要进行基因组拼接，是因为现在的测序技术还只能测较短的序列，无法直接获取一整条染色体的序列。如一代测序（Sanger测序）一般可测1kb左右的序列；二代测序（next-generation sequencing），一般可测50~500bp；三代测序虽然可测100kb甚至更长的序列，但现在三代测序技术还不是很成熟，还有较高的测序错误率。

宏基因组组装，即把短的reads拼装成连续的序列contig，再根据PE等关系将contig拼装成scaffold。与单个基因组组装不同，宏基因组组装最终得到的是环境样品中全部微生物的混合scaffold。理想情况下一条scaffold对应一个物种的全基因组。但由于序列太短或者覆盖度不够，很难拼出一条完整的基因组。针对高通量测序数据，出现了多种拼接算法和软件。

在生物测序中，contig和reads分别指以下概念：

reads：测序过程中获取的原始实验数据，通常是短片段的dna或rna序列。每个read的长度通常在50到500个碱基对之间。在高通量测序中，可以生成数百万到数十亿个read。

contig：在组装(reads assembly)阶段中，将相互重叠的reads拼接起来形成的更长的序列。contig大小取决于拼接这些reads的算法以及将哪些reads组装在一起。contig与基因组中的染色体区域类似，但相比于染色体，contig可能会有断裂和缺失。较大的contig表示已经组装好的较长序列，而较小的contig则反映了未被完全组装的序列。

2、简介

基因组装的一般过程：reads---->contig---->scaffold---->chromosome

基因组组装：将测序短片段根据重叠（overlap）信息组装成长大片段。

首先基因组测序产生reads，然后对reads进行组装产生长片段Contigs，再确定Contig的方向和顺序，组装产生更长的片段Scaffolds，最后再组装连接Scaffold得到完整的染色体序列。

 

Scaffold:为多条contig序列连接形成更长片段，这些contig方向和顺序已经确定，且contig间未知序列（一般用NNNN表示）的长度也获知。

Scaffold的获得一般主要通过双端测序（如paired-end sequecing或mate-pair sequencing）来确定contig的顺序和方向，以及contig之间的间隔距离，具体如下示意图所示。

3、特点

Megahit是一个超快和超高内存使用的NGS组装软件,尤其适用宏基因你组数据组装，也适用于通用的单基因组组装，例如单菌小基因组、哺乳动物大基因组以及单细胞数据

Megahit是一个二代测序从头组装工具， 用于以时间和成本有效的方式组装大型和复杂的宏基因组数据,和其他基因组组装软件相比，Megahit在计算时间和内存消耗方面有着巨大优势，适用于土壤等复杂环境样本的组装和大量样本的混合组装。

MEGAHIT将数据整体组装在一起，即不需要像分区和规范化那样的预处理。 与以前组装土壤数据的方法相比，MEGAHIT产生了三次更大的组装，具有更长的重叠群N50和平均重叠群长度; 此外，55.8％的读数与组装结果可对齐，较之前提高了四倍。

4、组装原理

de Bruijn Graph算法

基于DeBruijn组装思想:使用不同kmer迭代，选择最优结果输出

(1) Megahit执行多个k-mer大小组装策略，迭代构建了从小kmer到大kmer的多个SdBG组装图

(2) 较小的k-mer有利于过滤错误的边缘并填充地覆盖区域中的间隙，较大的K-mer可用于解决重复序列

(3) 在每次迭代中，Megahit都会通过去除tips，合并气泡并去除低局部覆盖率的边缘来清理潜在错误组装

 

Megahit尤其适用于宏基因组学测序，因为宏基因组学的物种预测深度极不均匀

5、使用

（1）conda安装

 

conda install -c bioconda megahit

（2）查看安装版本

megahit -v 

（3）输入文件

 

Megahit输入文件：fastq格式的测序文件（单端或双端），可以是gz/bz2压缩文件

Fastq，这是目前存储测序数据最普遍、最公认的一个数据格式， FASTQ存的是产生自测序仪的原始测序数据，它由测序的图像数据转换过来，也是文本文件，文件大小依照不同的测序量（或测序深度）而有很大差异，小的可能只有几M，大的则常常有几十G上百G，文件后缀通常都是.fastq，.fq或者.fq.gz（gz压缩）。

（4）基本命令

megahit  --presets meta-large  -t 30 --12 B1W10_1.fq,B1W101_2.fq -o ./megahit

--presets meta-large 这个函数是专门为宏基因组分析设计的，加上这个命令的话，它会组装几十遍，从中选出最好的那个，不加的话就组装一遍 这个非常重要，不能忽略，别人经常会忽略，这样显得专业

 

--12 双端 

 

-o ./megahit新建一个文件夹，把结果输入进去

 6、输入文件

这是一段FASTQ文件（Fastq格式），它包含了每个DNA序列片段的质量信息和相应的碱基序列。让我来解释这个样本。

第一行@E00488:222:HFMH2CCXY:1:1101:13798:2610 1:N:0:TCACCTCA 是描述DNA的标识符，其中E00488:222:HFMH2CCXY是机器的名字和流水号，1是pair number，:1101:13798:2610表示run, lane和tile information，后面的1:N:0:TCACCTCA则是用于矫正测序误差和分辨reads mapping方向的信息。

下一个行由碱基序列（CATCGACTTCGCCACCCTGACCTGCGCCGCCCGCGTCGCGCTCGGGCCGGATCTGCCGGCGATGTTCGCCAACGACGACCAGCTGGCCAGCGATCTCGAAAACGCGGCCAAGGAGGTCGCCGACCCGATTGGGCGAATGCCTCTGTGGGA）组成，它告诉我们基因组的DNA序列。

接下来是一个+，它告诉我们后面的数据是关于质量得分的信息。

最后一行则是关于质量得分的信息，其长度与碱基序列长度相同，在这种情况下，每个字符都对应一个碱基，用来描述该位置基因对序列的可靠性，不同的字符代表不同的亮度（可靠程度），例如，A通常表示较高可信度，而#则代表非常低的质量得分。

 7、输出文件

这段话是指Megahit软件在拼接 contigs 时生成的一个片段的相关信息，具体涵义如下：

• k127_1：表示这个 contigs 的编号为 k127_1。
• flag=1：表示这个 contigs 在组装中的状态，1 表示正常组装完成，0 表示异常终止。
• multi=2.0000：表示这个 contigs 在组装中被多少条 reads 拼接而成，2.0000 表示由两条 reads 组成。
• len=320：表示这个 contigs 的长度为 320 bp（碱基对）。
• CGTCGACGTGGCGCAGGACGTCATCATTGCCGAGCAGGACTGCGGCACGCTCGATGGCATCGAGGCGAGGGCCATTGTCGAAGGTGGCGAGATCATCGAGCCGTTGCGTGACCGAATCGTGGGTCGCGTGACCCTCGAGCGGCTGATCGATCCGTTCAACAATGAAATCATCCTCGATGCCAACGGTGAGATCACCGAAGACCTCGCGTCGGAGAACCAGGATGCCGTTATCGAGAAGGTGAAGATTCGCTCGGTGCTGACGTGTGCGACGCGGCGCGGTTGCTGCGCCCGTTGCTACGGGCGCGATCTGGCGACGGGCC：表示这个 contigs 的序列。