神经科学，基础概念入门，如何选择注射什么病毒？神经生物学基本常识
参考连接： 神经研究领域中如何用好工具病毒_已完成_丁香学社_丁香通
文章要点：
1、在神经生物学研究领域中，如果想看清楚大脑中神经元。有两个思路：1）通过转基因小鼠，让小鼠的神经元表达荧光蛋白；2）使用工具蛋白，尤其是AAV载体；周期短，成本低，操作简单；
2、啥是AAV载体呢？一般在什么语境下出现：“向成年大鼠基底外侧杏仁核注射1ul AAV-DHHC12来过表达DHC12。”
3、组织特异性启动子； 实现目的基因的细胞特异性调控；组织特异性启动子是从特定细胞专一表达的基因启动子鉴定得来的。其可调控外源基因在某些特定来源的细胞或组织部位中表达。比如：hSyn(神经元特异性启动子)； mecp2(较短的神经元特异性启动子)；c-fos（兴奋性神经元启动子）；CAMKIIa (前脑谷氨酸能神经元特异性启动子)；
4、Cre蛋白是一种重组酶，能够特异性识别细胞内基因；
5、Cre小鼠，是Cre重组酶在小鼠体内特定组织或细胞表达的小鼠。Cre基因的表达受控于一个特异性启动子，该启动子决定了Cre表达的组织和细胞类型。
6、Cre操作：1）让特定的细胞表达Cre；2）同时让所有细胞都具有一个沉默的不表达的光敏感蛋白的基因；3）特定细胞所表达出来的cre就会启动光敏感蛋白的表达。
7、Cre操作的方法：有四种，这里只关注一种。同时打带特异性启动子-cre的病毒，+ loxp光敏感蛋白的病毒。
细节内容：
1、神经领域的基本研究思路
2、在上边的框架下，常见研究课题走的是第二条路线：
要做成以上的事儿，对应三个需求：1、进行基因调控（比如，让某个基因过表达，干扰、敲除等）；2、神经标记示踪（比如想找某个环路，）；3、细胞操控和信号记录（如果关心环路，或神经元的功能，则进行生理的操纵）；
基因调控
（1）包括基因的过表达、干扰和敲除。研究中，可以构建转基因小鼠。当前则可选用工具病毒来实现（尤其是AAV载体被广泛的应用于神经系统基因的表达调控。优点是，周期短，成本低，操作简单，可实现多区域选择性表达，缺点是，无法获得稳定品系）；
（2）为什么 AAV 是载体？它干什么事呢？
语境：向成年大鼠基底外侧杏仁核注射1ul AAV-DHHC12来过表达DHC12。
从图中可以看到，有几个信息，需要注意：什么是promoter，bGlobin，DHHC12，eGFP，3FlLAG
他们分别是什么作用？C图又是什么常见的测量手段，结果说明了什么？
（3）AAV 组织特异性启动子； 实现目的基因的细胞特异性调控；
组织特异性启动子是从特定细胞专一表达的基因启动子鉴定得来的。其可调控外源基因在某些特定来源的细胞或组织部位中表达。
常见的真核和原核表达系统的启动子（promoters） 纽普生物
EF1a是什么启动子
EF1a 常规表达用 mRNA 人延长因子1α来源的强哺乳动物表达启动子 组成型 表达水平十分稳定，与细胞类型无关
这些启动子是某些细胞专一表达的基因。
案例：
利用 “谷氨酸能神经元” 的 “ 特异性启动子” CaMK II alpha。在谷氨酸能神经元中 特异性表达 Cre（表达我们的目的基因）；
AAV + 工具鼠， 联合 使用，实现目的基因的调控。该策略可以基于Creo-Loxp系统。
那么什么是Loxp系统，Cre到底是什么？ Cre酶？ 转向，目的基因和启动子，同向？
案例：
1、Loxp小鼠，注射AAV，快速实现目的基因的彻底敲除；（区域特异性）
2、实现细胞特异性；
2
3、快速实现 目的基因 细胞特异性 的 过表达或干扰，
自己设计的 基因序列；
如果把GOI换成shRNA后，可以实现组织特异性的目的基因干扰；
全身表达Cre的小鼠是什么意思？
目前细胞特异性表达Cre的工具小鼠种类 远多于细胞特异性启动子 AAV种类；
上述都是基因调控。下边讲的是
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神经标记示踪；
神经环路研究。神经科学的热点方向。
示踪，工具病毒的分类：
顺行：从胞体到轴突方向进行感染；
具体案例：
AAV-retro。找核团的上游核团。脑区。示踪目的脑区。
顺行的案例
顺行，跨单级的突触；
HSV顺行多级跨突触；
利用这种病毒，能够研究，中枢控制的外周器官；
HSV能够标记出神经云的精细结构
细胞操控和信号记录
我们找到的 神经元，在环路上，或者某一行为、或功能 的作用；
常用的工具有：光遗传学AAV，化学遗传学 AAV， 离子成像AAV；
光遗传学AAV，化学遗传学AAV，离子成像AAV；
光遗传学 AAV
看看细胞在环路中，扮演什么样的角色？
化学遗传AAV。用AAV表达一些 特异性受体；这些特异性受体，不识别内源性分子。只能特异性地识别外源性的CNO；当给了CNO之后，特异性受体和CNO结合，能够控制细胞兴奋和抑制（神经元的去极化和超极化）；
hM3Dq 最常用的功能，促使神经元放电活动；
hM4Di 能抑制神经元兴奋；
操控神经元之后，想看一下操控的效果如何？
表达钙离子指示剂蛋白。
这个过程好像工厂生产产品。载体AAV都是一样的，等价于拉货的卡车，没啥区别。但是订单不一样，有的是想让细胞生产光敏蛋白，有的想让细胞生产成像蛋白，有的想让细胞生产化学遗传的特异性蛋白。这里介绍的就是钙离子指示剂蛋白；将钙离子浓度变化，转化为荧光信号。
案例：
用aav表达hM3Dq，然后给小鼠CNO（化学遗传中涉及到的外源受体）
小鼠大脑中的神经元，到底有多少种类型？这里提到的是Phox2b阳性神经元。
cFos是神经元兴奋的一个Marker；
案例：检测目标神经元的活动变化；做疼痛的一个脑区；
总结：
神经科学的研究思路：
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工具病毒的使用；
常用的注射方法：
每个脑区不要注射太多；
脊髓内注射；
鞘内注射
不推荐；如果非要用的话，要用能扩血脑屏障的病毒； AAV-PHP.eB
感染的效果和效率怎么样。常用的检测手段有：免疫荧光共标染色；
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神经科学，病毒注射的四大常见问题： 1、定义位点不准，怎么办。多次试验，操作！ 通过注射颜色的染料；
2、如果没有荧光怎么办？分布Debug，第一，看看取材时间是否达到了病毒表达所需要的时间？第二，确定注射位点；第三，计量是否充足？第四，病毒是否有问题；
3、打完病毒之后，看不到细胞完整的形态。怎么办？ 可能的原因是，脱水不彻底。解决方案：延长脱水时间，重新配置蔗糖溶液。
4、注射位点四周有荧光，中心没有荧光，是什么原因。可能的原因是，注射的剂量过大，导致细胞毒性，死亡。解决方案，注射的计量稍微少一点。减慢注射的速度；
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% 如何理解SOM神经元：SOM+神经元是一类重要的抑制性神经元,但是数量稀少；
% 如何理解PV神经元：小白蛋白神经元（属于抑制性）；
% 如何理解VIP神经元：表达血管活性肠肽,神经元,这是一类中间神经元；
% 如何理解PYR神经元：椎体神经元；
% 什么是mCherry？红色荧光蛋白，他有个特点，可以和绿色荧光蛋白共同标记。 m是monmer的缩写，代表，单体。
% 什么是eYFP？黄色荧光蛋白。最大激发波长是514nm；
% 什么是ChR2？光敏感通道蛋白；
% 什么是wpre？可以把它理解成催化剂，能够增加目标基因的表达。
% 什么是CaMKIIa？钙离子通道蛋白；
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怎么让特定的神经元具有这些光敏感蛋白？
cre操作
