7种测序平台

1. illumina测序化学原理

2. HiSeq 测序仪工作原理

3. PacBio 单分子超长测序

4. Ion Torrent 测序

5. X10人全基因组测序

6. illumina 公司的Nano Well 测序技术

7.第一代DNA测序

 

1. illumina测序化学原理

今天的第一期节目，主要给大家介绍Illumina公司的技术。Illumina公司是当今最红火的二代测序公司。它的测序技术的最基本的原理，是基于可逆终止的、荧光标记dNTP来做“边合成、边测序”的工作

听起来有点拗口，接下来逐步为大家讲解。

Flowcell

第一个要给大家讲的，是它这个flowcell。Flowcell翻成中文，就叫“流动池”。

我们来看这个图片。图片当中，我们看到一个象载玻片大小的芯片。这个芯片里面，是做了8条通道。在这个通道的内表面，是做了专门的化学修饰。它的化学修饰，主要是用2种DNA 引物，把它（2种DNA引物）种在玻璃表面。

 

这两种（DNA引物的）序列是和接下来要测序的DNA文库的接头序列相互补的。而且这2种引物是通过共价键，连到Flowcell上去。之所以要用共价键连到Flowcell上去，是因为接下来有大量的液体要流过这个Flowcell，只有有共价键连接的这些DNA，才不会被冲掉。

这就是Flowcell。

文库制作

再接下来，讲一下文库、和文库的制作（过程）

所谓的DNA文库，实际上是许多个DNA片段，在两头接上了特定的DNA接头，型成的DNA混合物。

文库有2个特点，第1个特点，是当中这一段插入的DNA，它的序列是各种各样的。第2个特点，它的两头的接头序列，是已知的，而且是人工特地加上去的。

要做这个文库，首先是把基因组DNA，用超声波打断。然后打断之后，两头用酶把它补平，再用Klenow酶在3’端加上一个A碱基。然后，再用连接酶把这个接头给连上去。

 

连好了接头的DNA混合物，我们就称为一个“文库”。英文也称作“library”。

桥式PCR

 

做好了Library之后，就要做桥式PCR了。桥式PCR，实际上是把文库种到芯片上去，然后进行扩增，这样的一个过程。

这个过程，首先是把文库加入到芯片上，因为文库两头的DNA序列，和芯片上引物是互补的，所以，就会产生互补杂交。

 

杂交完了之后，我们在这里面加入dNP和聚合酶。聚合酶会从引物开始，延着模板合成出一条全新的DNA链来。

新的这条链，和原来的序列是完全互补的。

接下来，我们再加入NaOH碱溶液。DNA双链在NaOH碱溶液存在下，就解链了。而且被液流一冲，原来的那个（模板）链，也就是没有和芯片共价连接的链，就被冲走了。而和芯片共价连接的链，就被保留下来。

 

 

然后，我们再在液流池里加入中性液体，主要是为了中和这个碱液，在加入中和液之后，整个环境变成中性了。这时侯，DNA链上的另外一端，就会和玻璃板上的第二种引物，发生互补杂交。

接下来，我们加入酶和dNTP，聚合酶就延着第二个引物，合成出一条新链来；然后，我们再加碱，把2条链解链解开；然后，我们再加中和液，这时侯，DNA链会和新的引物杂交。再加酶，再加dNTP，又从新引物合成出新的链来。

连续重复这一过程，DNA链的数量，就会以指数方式增长。

 

制备单链

在桥式PCR完成之后，接下来要做的工作，就是要把合成的双链，变成可以测序的单链。

办法是通过一个化学反应，把其中一个引物上的一个特定的基团给切断掉。

然后，再用碱溶液来洗这个芯片。这时侯，碱让DNA的双链解链，那根被切断了根的DNA链就被水冲掉了。留下那根共价键连在（芯片）上面的链。

 

接下来，再加入中性溶液，然后在这个中性溶液里面加入测序引物。

正式测序

好，接下来正式的测序工作就开始了。

那么，在测序的时侯，加入进去的，最主要是2个东西：一个是带荧光标记的dNTP。而这个dNTP，它还有一个特点，它的3’末端是被一个叠氮基堵住的。

然后，再加一个聚合酶，聚合酶就会选择：哪一个dNTP是和原来位置上的那个碱基是互补的，根据互补性原理，把这个dNTP合成到新的这个DNA链上去。

因为这个dNTP的3’端是被一个叠氮基团堵住了，所以，它一个循环只能延长一个碱基。然后，它就停在那儿了。

 

 

合成完了之后，就用水把多余的dNTP和酶给冲掉。

冲掉之后，就放到显微镜下，去进行激光扫描。根据发出来的荧光来判断它是哪个碱基。

因为4种dNTP，它每一种dNTP上面标的荧光素都不一样，根据红、黄、蓝、绿，它出来的哪种颜色，那么，就可以倒过来推出来，这个新合成上去的碱基，是哪种碱基。

因为新合成的碱基，是和原来位置（的碱基）是互补的，所以，又推出模板上那个碱基是哪个。

这一个循环完成之后，就加入一些化学试剂，把叠氮基团和旁边标记的荧光基团切掉。切完了之后，3’端的羟基就暴露出来。

 

再接下来，加入新的dNTP和新的酶，然后，又延长一个碱基。新延长完一个碱基之后，把多余的酶和dNTP冲掉，再进行一轮显微的激光扫描，再读一下这个碱基是什么。

不断重复这个过程，可以重复上百次，到几百次，就可以把上百个碱基，甚至更多碱基的序列读出来。

读Index

那么，什么是Index哪？是因为Illumina的评委会个测序量很大，往往一个样本，用不了那么几亿条DNA。所以，科学家就想了一个办法。在文库的接头上做了一些标记，每一个样本，它有一个特定的接头，每个接头里面，它有一段特定的序列。

这段特定的序列，我们就称为Index。也有人把它叫做Barcode，反正，表达的是一个意思：这么一段特定的序列，标记了样本的来源。

那么，要读这个Index的序列，先用碱把上面这根测完“Read 1”的序列，把上面这根DNA链给解链掉。

 

解链掉之后，再加入中性液，然后，加入“Read 2”这个测序引物。Read 2测序引物结合的位点，正好，就在这个Index序列的旁边。

接下来，就进行第2轮测序，一般来说，是读6到8个碱基。把这6到8个碱基读下来，我们就可以知道，这某一个具体的一段DNA，它来自于原始的哪个样本。

双端测序

 

这是Illumina的最核心的另外一个技术，就是双端测序。

那么双端测序，就是说，一根DNA链，除了从正向读一遍，还可以从DNA的负向，再读一遍。

这一下子就把Illumina测序的有效长度加了一倍。这是非常有实际用途的。

那么这个倒链的过程，是这样，先让这个DNA先合成，合成出来这根互补链。

有了这个互补链之后，用一个化学试剂，在原来这根链的根上切一下。切一下，原来这根模板链就掉了，剩下那根互补链。

再接下来，就进行第2端的测序。第2端的测序原理，和第一端的测序原理是一样的。

加上了“Read 3”的这个引物，依次往下，一个一个碱基地往下读。

 

大规模平行测序

那么最重要的事情是什么呢？一个点，经过几百个循环，就读出了几百个碱基。但实际上，这个芯片上可以有上亿个点，上亿个“cluster”，也就是“簇”。那么上亿个“cluster”，每个循环，它都可以读出地么多序列，这是Illumina测序非常强大的原因。因为是成千上万，准确说是上亿上链都在合成，这个就得到了很大的一个测序数据量。

 

2. HiSeq 测序仪工作原理

上期节目，给大家介绍了Illumina测序的化学原理。这期节目，主要给大家介绍一下，Illumina HiSeq测序仪的工作原理。

也就是芯片上发生了这么多变化，HiSeq是如何把这些信息给读出来，并且把扫描出来的荧光信号，又通过怎样一系列的加工，变成可以识别的“A、C、G、T”的碱基序列的。

HiSeq首先是一台高精度的显微光学扫描仪。然后再配上了一整套的液流系统，和计算机软硬件，再加温控系统，组成这样一台测序仪。

其中最核心，也是结构最复杂的，是它的光学系统。

前一期，我们讲了，Illumina测序仪主要是靠4种dNTP分别带有不同的荧光基团，在被激光照了之后，发出不同颜色的荧光。再通过对光的颜色的分辩，可以判断出到底是哪个碱基。

光路结构

我们先来说，它的光路结构。

这里，我们要说明一下：感光元件CCD，它本身是色盲。所以，它一定要配合滤光片，才能分辩出颜色来。

那我们先来看一下，HiSeq的光路图。

 

左边这两个元器件，就是激光器。一个发出红色激光，另一个发出绿色激光。

其中红色激光主要是激发A和C，这两种碱基上的荧光基团；而绿色激光主要是激发G和T，这两种碱基上的荧光基团。

红色和绿色这两束光，通过一面半透半反镜，组成一道激光。这道激光打在Flowcell上。

 

那么请注意，Flowcell就放在这个位置。

在Flowcell里面，结合在DNA上的那个荧光基团在激光的照射下，就发出荧光。

荧光通过3面半透半反镜，和1面全反镜，被分成4条光路，这4道光线，分别通过一道滤光片，这4张滤光片的滤过波长不一样。这样，这4 道光在经过了滤光片之后，就变成了4种颜色不同的光线。

然后，这4条颜色不同的光线，各自照在一面反射镜上，通过反射镜进入到CCD。这4个CCD就记录到不同颜色的光线。

TDI线扫描

HiSeq的光线扫描是“线扫描”，和传统的相机不一样，传统的相机是面扫描。

HiSeq采取了一种特定的叫“TDI”线扫描方式，TDI是Time delayintegration的缩写。

在HiSeq上之所以采取TDI扫描方式，因为它有非常明显的优点。

第一个优点，就是它的扫描速度非常快，在HiSeq 2500上，从Flowcell的一个Lane的一头扫到另外一头，也就是一个“Swath”的扫描时间，大概只有20秒种不到。

第二个好处，就是它的扫描精度非常高。在最新的HiSeq V4版试剂上，它的光点密度，大概可以达到每平方毫米90万个点，要扫描清楚这么高密度的光点，扫描仪的扫描精度是可想而知的。

TDI扫描的第三个好处，是这种方式，可以把Flowcell的上表面、和下表面都扫描到。

Flowcell（测序芯片）

接下来，我们再要详细介绍这张Flowcell。

 

那么，先来看一下，这张flowcell有点象一张载玻片，在这一张片子里面，我们可以看到，

它做了8条通道。

每条通道，我们称为一个Lane。这8个Lane之间，相互是隔绝的。

每个Lane的两端各有一个小孔。这两个小也孔，就是液流流进、流出的地方。

 

每个Lane的上表面和下表面，都分别以共价键的方式，种了2种DNA引物。这两种DNA引物，是与文库接头的两头序列相互补的。上一期（节目）我们已经说明了这一点。

 

一个Lane里面，分成2个面，上表面、和下表面。上表面和下表面，都种了DNA引物，也都是可以产生测序数据的。

在每一条Lane的每一个面，又被分成了3个扫描通道，每个道被称为一个“swath”。

 

 

每条Swath是从头到底被连续扫描的。但是它的数据，在进行数据分析的时侯，是被分割成16个小方块。这每一个小方块，被称为一个“tile”。

这样一张Flowcell，总共就是768个Tile。

每个Tile在扫描的时侯，会根据4种颜色，产生4张照片。

 

图像处理

扫描完了之后，就要进行图像处理。

扫描出来的最原始的文件，它的格式是“.tiff”文件。

Tiff文件记录了每个像素点上采集到的光强度。Tiff文件的优点是它是完全无损，保留了所有的原始信息。

但它也有它的不足之处。它的不足之处就是它的这个文件太大了。它的数据量很大，既不便于数据的传输，也不便于数据的存储。

接下来，计算机软件就把图像文件转化成光点文件。光点文件叫“.BCL”文件。也就是“Base calling”的英文缩写。

要把图像文件，转化成BCL文件，就是把4种颜色的4张照片，组合在一起，变成一张有4种颜色的彩色照片。

 

 

这其中首先要解决的，是4张照片在空间位置上的匹配问题，因为4张照片是通过4个CCD分别拍下来的，所以，会有一定的空间上的偏差。

软件要通过对4张照片上，亮点相互比对，找到最合适的、匹配的位置。

这里，我们要说明一下，如果被测的文库是碱基不平衡的文库，在这个空间匹配上就会遇到问题。

什么叫碱基平衡呢？也就是说，在测序过程当中，每个循环，A、C、G、T四种碱基，都是比较均匀在存在的。

最典型是人全基因组文库，这是一个典型的碱基平衡文库。

那什么是碱基不平衡文库呢？最典型的，就是PCR扩增子产生的文库。PCR扩增子的特点：PCR是有特定的起始位点的，一个特定的测序循环中，几乎所有的片段都是同一种碱基，而剩下的3种碱基，就特别少。

这在反映到照片上去的时侯，就变成：一张照片特别亮，光点很多。而其它的三张照片就特别暗，上面的光点就很少。

这时侯，要软件做空间上的比对，软件就会觉得困难，因为对于那几张暗的照片，软件很难判断上面的光点，是否与那张亮的照片上的光点真正对得上。结果，就是判断出来的可靠性变差。最后，就是测序的数据质量变差，有效数据量也会变少。

要解决这个问题，办法是在测序过程中掺入一些碱基平衡的文库。例如掺人全基因组文库。或者也可以掺Illumina提供的标准的PhiX文库，这些都是碱基平衡文库。

它的作用，是在每个循环当中，为每一种颜色的照片，都提供足够多的亮点。这样，它可以弥补那些不平衡的文库当中缺亮点的问题。

BCL文件

当把4种颜色的光点组成一个文件之后，软件就会生成一个“.BCL”文件。

“.BCL”文件就是光点文件，它对每个光点，记录了以下的内容。

 

首先一个光点处在哪个Lane里面。其次，这个光点在这个Lane的哪个Tile里面。第3，就是这个亮点在这个Tile的X轴和Y轴的座标位置。第4，是记录了这个光点当中“红、黄、蓝、绿”四种光的对应的光强。

这个图是BCL文件的一个示意图。

实际上，BCL文件是二进制文件，无法拿来直接阅读。也正是因为BCL文件难于阅读，并且很难改动，所以，BCL文件几乎不存在做假的可能。

在测序过程当中，有许多客户会要求测序公司提供原始的测序数据，如果客户是包Lane、或者包Flowcell的，一般测序公司是可以提供BCL文件的。

客户在拿到BCL文件之后，可以用“BCL2FASTQ”这个软件，把BCL文件转化成FASTQ序列语文件。

以此，客户可以来验证，测序公司提供的数据是否是原始的，是否是真实的。

再说一下最初生成的那个tiff文件。tiff文件实在太大了，所以，测序仪在测序过程中，只把tiff文件作为中间文件。最后是把这个tiff文件删掉的。

如果客户想要原始的图像文件，在HiSeq V4之前，可以让测序公司保留“.CIF”文件。CIF文件是一种彩色图案的向量文件，它的优点是比tiff文件的数据量小很多。

测序公司把CIF文件给客户之后，客户就可以看到原始的图像文件了。

但是，请注意：在HiSeq升级到V4之后，保留CIF文件的这个选项是被取消掉了。所以，对于要测V4 Lane的客户来说，是拿不到CIF文件了。

碱基识别

接下来，我们讲一下碱基识别。

我们之前讲：4种dNTP，各标一种荧光基团，红、黄、蓝、绿，四种颜色，根据颜色来判断碱基种类。这个实际上是一种简化了的说法。实际情况，要比这个复杂得多。

来看这个图，这是2种荧素的荧光的波长图。

 

我们会发觉，这两种荧光色，它发出来的发射光，它在波长上是有交叠的。在X的这个位置，主要是绿色荧光素的贡献，但是蓝色荧光素，也有少许贡献。

而在Y这个波长位置，蓝色荧光素是做了主要贡献，但是绿色荧光素，也有少量供献。

在实际测序过程中，是4种荧光素发出的亮，相互有交叠，相互之间的交系，变得更加复杂。

那么，现在我们要做的事情，是把A、C、G、T，4种荧光素的贡献给拆开。

首先，我们就要确定4种荧光素在4个被测波长处的贡献率。

我们可以看一下，这个表，就是4种荧光素，在4个波长分别有不同的贡献率。这样就组成一个4X4的贡献率表格。

我们在实际的分析当中，等于解一个4元1次、4联方程。因为是4个未知数，又是4个方程，所以肯定是可以解出来的。

 

说解方程，有点复杂。那么我们来打一个比方。让大家来理解这个事情。

假设有一家饭店，它有4个熟客：甲、乙、丙、丁。它日常又提供4道菜：猪肉、白菜、黄瓜、花生。大厨知道：甲最爱吃猪肉、乙最爱吃白菜、丙最爱吃黄瓜、丁最爱吃花生，每个人来了饭店之后，主要吃自己最爱吃的，也会吃些别的菜，但别的菜都吃得不是太多。

 

那么这个大厨不到前台，看不到今天来的客人。如果，这个大厨想要知道今天来的客人是谁，他有什么办法呢？看今天哪个菜被吃掉得最多。如果今天的菜被吃掉的最多的是猪肉，那他可以大致地判断，今天是甲来过了；如果他看到今天被吃掉的菜，最多的是白菜，很可能是乙来过了；那么其它的，道理也是一样的。希望这个例子可以帮大家来理解一下，这4个荧光和4种碱基的判读的关系。

Phasing 和 Prephasing

接下来，我们再讲一下，Phasing和Prephasing。

在Illumina的测序过程当中，一个簇，大概有5千个到1万个分子。但是在边合成、边测序的过程当中，每一步酶反应，理想情况下，应该这5千个分子都延长1个碱基。

但实际情况，总有少量分子没有完成延长反应。也就是说，总有少量的分子会掉队，我们称这种掉队的现象叫“phasing”。Phasing主要是由于酶活性不足，所引起的。

如图所示，掉队的这个分子，它所发出的荧光信号，和大部队所发出的荧光信号是不一样的。这个循环的次数越多，掉队的分子就越多。所以，测序越到后面，它Phasing的分子数就越多。最后，信号的可靠性就越差。

除了掉队的分子，还会有一部分分子，会跑得超前，也就是在一个循环中，它延长了2个碱基。在一个循环中延长了2个碱基的最主要的原因，是dNTP上标记的那个叠氮基团(N₃)掉了。

我们知道，叠氮基团是非常容易从有机化合物上掉落的。当叠氮基团掉落之后，dNTP的3’端的羟基就暴露出来了。当丢失了叠氮基团的dNTP加到（合成链的）3’端之后，它的聚合反应不会终止，而是会继续往前走。当再加上了一个带叠氮基团的dNTP之后，这个聚合反应才停下来。

这样的后果，就是一个循环，某些分子，会合成了2个碱基。也就是说比大部队多走了一步。那么这个多走了一步的碱基，它所发出来的荧光颜色，也是和大部队不一样的。

在Illumina测序过程当中，Phasing和Prephasing是限制测长的最主要原因。也就是说，随着循环不断进行，越来越多的分子掉队，还有越来越多的分子超前。然后，它们所产生的噪音，掩盖了大部队的信号的时侯，也就是测序开始测不准的时侯。

在HiSeq测序当中，从第12个循环开始，在计算某个光点是哪种碱基的时侯，就要把Phasing和Prephasing的影响，纳入考虑。

 

 

Chastity 和 Pass filter

为了对光点当中荧光素的纯粹程度进行描述，Illumina公司定义了个标准，叫“chastity”，Chastity的定义，就是浓度最高的那个荧光素的量，去除以“它自己 + 排名第二的荧光素的量的和”。大于0.6是一个好碱基。

用更加通俗的话来说，也就是“老大”比“老二”，如果大于、等于“1.5倍”，这就是个“好”碱基。如果“老大”比“老二”不足“1.5倍”，这就是个“坏碱基”。

Illumina对每个read的质量都要做一个检验，这个检验就叫“pass filter”检验。检验的标准，是看前25个碱基当中，有几个是“坏碱基”。如果只有一个、或者没有坏碱基，则Pass filter就通过；如果有超过一个以上的坏碱基，Pass filter就不能通过。

那我们平时说，测序服务保证多少“PF data”，指的就是Pass Filter(PF)的数据。

Pass Filter最主要的作用，就是把那些一个光点当中，含了几个cluster的那些点，给去掉。只剩下那些纯粹的单克隆的read，作为合格的数据，提交给客户。

我们平时说“PF率”，指的就是Pass Filter的Reads数，占总的、测到的Reads数的比例。

PF率可以从一个侧面反映测序的质量。一般来说，如果上样密度过高，PF率就可能会下降。

Quality Score，Q 值

一个碱基的Quality Score，也就是这个碱基的质量分数（Q值）。这个是通过这个碱基被误判的可能性，换算出以10为底的对数，再乘以“-10”得到的这样一个数字。

这个Q值，有点象我们说黄金的纯度，我们说“三九金”，或者说“四九金”，就是指99.9%的纯度的金子，或者是99.99%的纯度的金子。

我们平时说Q30，就是指一个碱基的可靠性达到99.9%。或者说，它的出错的可能性小于千分之一。

同样道理，我们说Q40，就是指一个碱基的可靠性是99.99%。或者说，它的出错的可能性是万分之一。

那么，我们经常说Q30比例，所谓的“Q30比例”，就是在全部PF数据当中，达到、或者超过Q30质量标准以上的数据，占所有PF数据的比例，叫Q30比例。

Q30比例，可以表征一个测序过程的质量的好坏。一个碱基的质量分数，不是以数字方式，直接记录到最后的Fastq文件的。而是把它的Q值，加上33，再用ASCII码表转换成一个字母，把这个字母录入Fastq文件。

这样做，有2个好处。如果我记2位数字，那么就占2个字节，现在用一个字母来记录，只占一个字节。那（数据存储）空间就节省了很多。

第二个好处，用ASCII码字母表，一个碱基，只对应一个字母；如果是用2位数字来记录，就有可能发生移码错误。而用ASCII码，一个字母来记录，就不太容易发生移码错误。

 

Fastq 文件

在软件做完上述所有的数据处理之后，就会生成一个Fastq文件。

Fastq文件里，主要包含了3部分内容。

第一个部分，是每个Read的目录信息。也就是这个Read来自于哪台HiSeq、第几个run、第几个Lane、和第几个Tile，以及在这个Tile的X、Y的什么位置。

接下来，就是所测到的碱基的序列。

最后，是这些碱基序列对应的质量分数信息。

这个，就是Fastq文件。

到Fastq文件之后，测序仪所要完成的工作，就完全完成了。

以上，就是HiSeq测序仪的基本工作原理。

 

3. PacBio 单分子超长测序

 

本期节目，给大家介绍一下Pacific Biosciences公司的技术。Pacific Biosciences公司的简称叫PacBio。Pacbio是目前读长最长的测序技术公司。

 

它的读长，最长可以达到2万到3万个碱基，平均可以达到8千多个碱基。相比于llumina 和Ion Torrent的几百个碱基的读长来说，有着明显的优势。

 

今天，我们就给大家介绍一下这个技术。

 

PacBio 测序过程

 

PacBio的测序原理，和别的高通量测序的原理，基本上也是一样的。也是边合成，边测序。

 

首先，这个聚合酶是固定在测序小孔的玻璃底板上。这个聚合酶又和DNA模板、测序引物是结合在一起的。

 

 

然后加入带4色荧光的dNTP底物，这些dNTP都在其磷酸基团上被标上了荧光基团，四种碱基、各标一种颜色。

当一种与聚合酶正要合成的碱基一致的dNTP被酶抓住的时候，酶就会长时间地抓住这个dNTP,不让这个dNTP漂走。

 这时侯，激发光从小孔的底部照进来，打在这个被抓住的dNTP上，就会在较长时间内发出荧光。

 

仪器根据所拍到的荧光的颜色，就可以来判断，这个碱基是哪种碱基。

一个循环的聚合反应发生完毕之后，焦磷酸基团就从原来的dNTP上掉下来，因为荧光基团是连到这个焦磷酸上的，所以这个荧光基团也就一起掉下来了，在溶液中就会漂走。

接下来，进行第二、第三个循环……，一直进行下去。

一张芯片上有几万个孔，同时进行测序，这样一次就可以得到几亿个碱基的序列。

 

接下来，分几个要点，来说明这个测序的过程。

化学方法

和Illumina一样，PacBio也采用了4色荧光基团来标记dNTP，但是PacBio的标记和Illumina的标记有所不同，PacBio的荧光基团直接是标在dNTP的3'端的磷酸基团的末端的。

这样标记的好处是：当一个聚合反应的循环完成的时侯，dNTP上的那两个磷酸基团就掉下，连在这个磷酸基团上的荧光基团也随一块儿掉下来。它掉下来之后，就在溶液中漂走，不会影响接下来的测序过程了。

测序微孔

然后，我们说一下这个测序小孔的设计。

 

这个测序小孔叫Zero Model Waveguide，简称ZMW。

小孔的直径很小，光只能在小孔中传输很短的距离。这个特点对PacBio的测序很重要。因为酶是被固定在玻璃底板上的，所以，只有互补的dNTP被酶抓到的时侯，这个dNTP才会较长时间地停留在离玻璃底板很近的位置。

也只有这样，才会被激发光照到，并且发出它的荧光。

 

PacBio的光学设计中，入射光是几百纳米波长的可见光,光从小孔的底部的玻璃处照到小孔中来。这个，只有70纳米。

其它游离的dNTP，只会非常短暂地进入小孔，又很快漂走。所以，这些游离dNTP带来的的噪音（信号），就被抑制在很低的水平。

哑铃状的文库

接下来，我们说一下PacBio的建库。

PacBio的建库是比较特别的。它的库是在DNA片段的两段各接一下发夹型的接头。接好了发夹形的接头之后，形成的文库是一个哑铃形的文库。

这种哑铃形状的文库有个好处，那它整个分子实际上是一个圆环。在测序的过程中它可以周而复始地进行测序，这对于发挥PacBio的长读长的优势是很有益处的。

超长读长的根本原因 -- 单分子测序

接下来，我们说一下PacBio它测序长度优势的来源。这个来源，是因为它测的是个单个分子。

相比之下，Illumina或者Ion Torrent测的都是一簇分子。或者说它们测的都是一大堆分子。当它测一大堆分子的时侯，每个循环，多多少少，总有一些分子落后；也多多少少，有些分子超前。

这些落后、或者超前的分子，在每个循环里面就会给出噪音。而且，随着循环次数越来越多，落后、和超前的分子也会越来越多，达到一定程度的时侯，噪音就会很大，大到会掩盖掉信号。

当噪音大到掩盖掉信号的时侯，实际上测序就测不准了。

相比之下，PacBio它只有一个分子，所以，它不存在同步问题。

这就让它可以测到几千、基至上万个BP都可以达成。

碱基判读准确率：87.5%

接下来，我们要说一下PacBio测序的缺点。

最大的缺点是对碱基的判读不准。它的错误率是12.5%。也就是说，它每读8个碱基，就有一个是读错的。

那么它主要的错误类型是"插入"。也就是说，它会多读一个碱基。

好在，它的这种错误是随机的。也就是说，你在这个地方再读一遍，它不一定会发生同样的错误。那么，对于同一个序列，多测几遍之后，这些偶然误差，可以被校正过来。

读长限制因素

接下来，我们说一下限制PacBio读长的因素。

第一个因素，就是DNA链上出现了缺口。测序过程中是用激光照射来发出荧光的，所以当强光长时间照射DNA链的时侯，DNA链就有可能被照断掉，出现缺口。

当酶读到这个缺口的时侯，酶就从模板链上掉下来。这时侯，测序就终止了。这是第一种可能。

第二种可能，是光线照射情况下，酶有可能会变性，当酶发生了变性之后，失去了聚合酶的功能，这时侯，测序也会终止。

第三个限制因素，是文库本身的长度。因为要做片段长度大于20~30K的文库，是有相当大的困难的，所以，文库本身的质量，在一定程度上，也限制了PacBio的读长。

数据通量

在高通量测序当中，测序的通量，是一个很重要的技术指标。

那PacBio大根一张芯片一次可以测到0.3~0.4G的数据。

在PacBio测序中，芯片上的小孔数是第一个绝对的、限制性的因素。

目前的芯片，是有15万个小孔。

但这15万个小孔中，并不是每一个都能产生有效数据的。

这里，我们要说一下，测序复合物和玻璃底板结合的方式。

所谓的测序复合物，就是"聚合酶、测序模板、测序引物"这三者组成的复合物。

这个复合物是通过聚合酶连接到玻璃底板上的。

这个连接方式，首先在聚合酶上标上生物素。然后，在小孔的玻璃底板上标上链霉亲合素。

实验过程当中，利用生物素和链霉亲合素的亲合力，把两者（聚合酶、和玻璃底板）结合到一块儿。

在实验过程当中，这个测序复合物是被随机地铺撒到这15万个小孔中的。因为是随机地铺撒进去的，所以，有多少个小孔里面正好有一个测序复合物，是符合泊松分布的。

最理想的情况下，是有1/3的小孔是正好有一个测序复合物。这时侯，还有约1/3的小孔是空的，还剩下约1/3的小孔是有2个或者3个以上的测序复合物被种进去。

空的这些小孔，因为接下来它没有聚合反应发生，也没有信号，那当然是废掉了。

那么有2个复合物种进去、或者有更多复合物种进去的这些小孔，因为它产生的信号会非常的杂乱，所以，这些孔实际上也是没用的。它产生的数据，在接下来的数据分析当中，是会被去掉的。

一张芯片有15万个孔，其中1/3有效，也就是说，有效的孔数是5万个。然后乘以它目前的平均测长，大概8千多个碱基，所以，一张芯片，比较理想的情况下，大概有0.4G的数据量的产出。

直接测DNA修饰

PacBio在测序当中，可以直接测到碱基的被修饰状态。因为当聚合物，遇到模板上有甲基化的A、C等碱基，它测序的速度就明显地放慢。而且它的光谱特征会发生改变。这样，就可以判断，这个位置上的DNA被甲基化了。

 

GC Bias 很小

PacBio测序还有另外一个好处，就是它GC Bias很小。

什么叫GC Bias呢？就是我们知道，所有的PCR的过程，如果模板里面G、C（碱基）的含量比较高，PCR的效率就比较低。反之，A、T（碱基）的比例比较高，则它PCR的效率比较高。

传统的建库当中，一般都有大量的PCR的过程。它导致的一个结果，就是G、C含量高的那些片段，它读到的Reads数，就会比较少。

PacBio它的好处，就是它的建库过程中没有PCR过程，所以，它带来一个直接的好处：就是它测序过程当中，GC Bias很少。也就是说，那些高GC的片段，有和低GC的片段差不多的概率被读到。

 

测序速度极快

高通量测序的另外一个指标，就是测序的速度。PacBio的测序速度取决于酶反应的速度。

目前PacBio用的这个酶，大概1秒钟是合成3个碱基，1个小时大概就可以合成1万多个碱基，3个小时可以合成3万多个碱基。到3万多个碱基之后，基本上继续在读的Reads，已经几乎没有了，所以，3个小时之后，测序基本就完成了。

1个Run读三个小时，相对于Illumina的测序速度来说，是非常快的；相对于Ion Torrent的测序速度来说，也相对要快一点点。

所以，PacBio是一种非常快的测序方式。

国内现有PacBio测序仪的单位

最后，把国内已经采购了PacBio测序仪的单位，列个清单，以方便大家相互合作。

• 天津市湖滨盘古基因科学发展有限公司，4台PacBio. http://www.pangugene.com/

• 北京遗传所，1台PacBio

• 北京药植所，1台PacBio

• 上海南方基因中心，1台PacBio

• 云南动物所，1台PacBio

• 武汉邓子新教授实验室，1台PacBio

• 天津生物芯片中心，1台PacBio

• 海克维尔基因（北京）研究院，1台PacBio

• 北京华牛世纪生物技术研究院，1台PacBio

• 上海交通大学 分析测试中心，1台PacBio

• 内蒙古农业大学，1台PacBio

• 华大基因，1台PacBio

4. Ion Torrent 测序

 

今天，要给大家介绍的是Thermo Life公司的Ion Torrent测序平台的测序原理。

 

 

 

我们分成以下4个部分来介绍Ion Torrent的测序原理。

 

1. 建库过程

2. 文库通过油包水PCR过程，变成可以上机的珠子的过程

3. 上机测序过程

4. Ion Torrent测序平台的优缺点

 

 

 

1、建库过程

 

 

 

那么，我们先来介绍一下建库过程。

 

建库是在样本DNA片段的两侧加上标准的接头的这样一个过程。

 

 

Ion Torrent的建库中，接头是平头的，这点是与Illumina文库的接头是3’端有带突出的T碱基粘性末端的是不同的。

 

在加接头的过程当中，是加入P1接头，并同时加入X接头或者A接头。

 

其中，X或A接头是未来的测序起始端。而P1接头是是连到测序珠子的这一端。

 

X接头和A接头的差别是：X接头是带Barcode序列的，而A接头是不带Barcode序列的。用X接头的好处是可以把一个芯片的测序通量分配个几个文库，测完序之后用Barcode把不同的文库的序列给分开。A接头的好处是直接测到样本序列，这样对于充分利用测序的读长是更好的.但是它的缺点是没有Barcode，所以一张芯片只能放一个样本。

 

 

在Ion Torrent测序当中，AmpliSeq文库是很一种非常常见的文库。AmpliSeq文库是通过多重PCR扩增出来的DNA，再加上接头，做的文库。

 

如果把整个的PCR扩增产物都拿来测序，那么测到的两头20~30个碱基，都会是PCR引物的序列。而PCR引物是人工设计的，它的序列是已知的。如果把这些PCR引物都进行测序，那就会浪费相当大的一个测序读长和测序数据量。那为了解决这个问题，Thermo Life公司在设计Ampliseq的PCR引物的时侯，在这个引物上特别设计了一种化学修饰，这种化学修饰可以被Fupa(视频中写作Pufa，正确的该是Fupa)试剂所切断。这样，利用Fupa试剂把PCR扩增产物上大部分的引物序列都给切掉。在测序的时侯，就可以尽可能多地测到样本序列。

 

这是一个非常巧妙的设计。

2、油包水PCR

在做好文库之后，接着就要做第二步：就是把文库种到测序珠子上去，并且进行扩增。

Ion Torrent把文库种到测序珠子的方法，是做油包水PCR。也叫EmulsionPCR(乳浊液PCR)。油包水PCR包括两个相：油相和水相。其中水相是核心，油相起到分隔作用。水相中包括文库、引物、酶、Master Mix、测序珠子，这5种PCR反应的主要成份。

其中这个测序珠子，它是接下来测序的核心载体。这个测序珠子是非常小的，PGM测序仪上用的珠子，它的直径大概平均是2.4微米；Proton PI测序芯片上用的珠子，它的直径，大约只有一个微米。这些测序珠子的表面，共价连接了许多PCR引物，这个引物的序列正好是和前面文库的P1接头是互补的。

每一个油包水PCR都会包含许许多多个这样的、小的测序微珠。

水相中的另外一个成份是那个游离的PCR引物。这个游离的PCR引物，它的5’端标记了生物素。这个标记的生物素的作用，我们后面还要讲到。

这个引物的序列，是和前面的A接头、或者X接头相一致的。

准备水相，就是把文库、引物、酶、Master Mix、测序珠子先在水相中混合好。

混合好之后，加入油。把油和水进行混合，形成乳浊液。在这个乳浊液当中，大部分是油。油把水相分隔成一个一个的小水滴。

每个小水滴当中都可能含有0个到若干个文库分子，还会包含0个到若干个的小的测序微珠。与此同时，引物、酶、和dNTP是过量的，所以几乎每个小水滴中都会有足够量的引物、酶、和dNTP。在整个油包水PCR反应当中，文库分子和测序微珠是限量因素。

 

接着，把混合好的乳浊液，进行PCR反应。

PCR反应的结果是，在一个小水滴当中，如果它同时有文库分子、和测序微珠，它就会发生PCR反应。如果缺少了文库分子、或者测序微珠，它就不会发生PCR反应。

PCR反应之后，珠子的表面，就会长出以同一个液滴当中，所含的DNA（文库）分子的扩增拷贝来。这些扩增出来的DNA链，是通过共价键连到珠子上的，这个共价连接，可以保证在接下来的测序过程当中，这些连到珠子上的DNA链，不会被（液流）冲走，那么这些DNA链就可以作为稳定的测序模板。

油包水PCR完成之后，要把所有珠子当中，那发生了PCR的珠子给纯化出来。

纯化的手段，是通过用标记了链霉亲合素的磁珠，和刚才经过PCR扩增反应的珠子进行混合。那些发生了PCR反应的珠子，它上面的DNA链，是连了一个从PCR扩增引物中带的生物素的，生物素会和链霉亲合素很牢固地结合。这样磁珠就会和发生了PCR反应的测序珠子结合在一块儿；而那些没有发生PCR反应的珠子，它上面没有连着生物素，所以，它不会和磁珠结合。

接下来，我们用磁铁来进行吸附，磁铁会吸附磁珠，磁珠会把带了生物素、同时带了扩增了的DNA链的那些测序珠子给富集起来，而那些没有和磁珠结合的那些微珠，是留在上清液当中的，通过清洗，就被洗掉了。

然后，通过专门的洗脱液，把磁珠所富集起来的测序珠子给洗脱下来。

3、上机测序

这些洗脱下来的珠子，就可以上机测序了。

第3部分，我们来介绍Ion Torrent的上机测序。

Ion Torrent测序芯片，是一人半导体芯片，上面做了数以百万、千万计的小孔。它每个小孔的既是测序微珠的容器，又同时是一个微型的PH计。每个小孔正好可以容纳一个测序微珠。在测序过程中就是通过测量、并记录每个小孔中，所发生的PH值的变化，来测出DNA的序列的。

每个芯片，都会有一个进口，还会有一个出口，是走液流用的。把测序珠子上机的时侯，就从进口把珠子的混悬液注入到芯片上。然后再把这个芯片离心一下，离心的作用，是更好地把珠子卡到小孔中去。

Ion Torrent的测序原理是：每个dNTP分子都有3个磷酸基团，当dNTP被聚合酶结合到DNA链上时，会掉下来的一分子的焦磷酸，1个焦磷酸分子会被酶再进一步分解成2个磷酸分子，这样，在测序的微环境中，就会多出两个酸性分子，一个珠子上有几千、几百条DNA链，每次发生聚合反应，就会多出几千、几百个酸分子。这样，这个微环境的PH值就会短暂地下降。

这时，Ion Torrent芯片中，每一个小孔中的PH电极，就测量这个小孔中的PH值变化，并且把测量得到的值传给计算机。

分别含Ａ、C、G、T四种dNTP的溶液，分别地、依次地流过芯片的表面。

举例来说，流入的是dCTP溶液，而模板上正好有一个G碱基，就发生聚合反应，并产生电压变化，而且会被记录下来。如果流入的溶液与模板上的碱基不匹配，就不会发生聚合反应，也就没有电压变化，也就不会有碱基被记录下来。

如果正好有2个一样的碱基相邻，一次就会有2个碱基被聚合到DNA链上，电压变化值就会加倍，序列中2个新的碱基被记录下来。

在测序的序列安排上，最前面的4个碱基叫Key sequence，分别是A、C、G、T。因为每个珠子上长多少个DNA链，它的变化范围是很大的，所以用Key Sequence的A/C/G/T四个碱基所测到的PH值变化的强度，来确定这个珠子的正常的信号强度。有了标准的信号强度之后。后面测到的信号，都和这四个碱基的信号强度进行对比，如果是一倍强度，我们就知道有一个碱基，如果有2倍的强度，就知道串联了2个相同的碱基，依此类推。

在整个的测序过程中，影响有效数据量的因素有以下这些：

 

第一，  一张芯片上，在所有的预制孔中，有多少孔是有珠子进入的。ISP density，也就是Ion Sphere™ Particles (ISPs)。比较理想的情况下，ISP density可以达到60~80%之间。这个值一般是由把珠子加到芯片上去的这个过程所决定的，加载得越好，则有珠子的孔数越多，没珠子的孔越少

第二，  是珠子上是否长了文库DNA链。这个指标，是由磁珠纯化的过程来决定的。纯化得越好，则有文库DNA的珠子越多，没文库DNA的珠子越少

第三，  是单克隆的珠子、和多克隆的珠子的比例。所谓单克隆的珠子，就是在一个珠子上只长了一种DNA分子。而多克隆的珠子，是指一个珠子上长了2种或者2种以上的DNA分子。

1. 在Ion Torrent测序过程当中，只有单克隆的珠子才可能产生有用的数据。而多克隆的珠子所产生的数据是乱的，是没有用的。

2. 产生单克隆的珠子，还是多克隆珠子，是在油包水PCR过程当中，一个水滴当中包含了几个DNA文库分子来决定的。如果一液滴中，一开始只包含了一个文库分子，做出来就是单克隆的珠子。如果一个液滴当中包括了2个、或者2个以上的文库分子，做出来，就会是多克隆的珠子。

3. 那么产生多少个多克隆的珠子，又产生多少个单克隆的珠子，它是一个统计的过程。是符合泊松分布的。

4. 目前，理想情况下，大概可以达到70~80%左右的珠子是单克隆的珠子。

第四，  是珠子上长的是否是有用的样本序列

1. 所建文库当中多多少少会含有一部分的引物二聚体。引物二聚体的序列，是无用的序列

2. 测到的序列当中，有一部分的序列质量低于可接受的水平，这是会被去掉的

3. 还有，在测序过程当中，一般会加1%的阳性对照珠子，这些对照珠子是进行质量控制的，但是这些阳性对照珠子上所测到的序列，也是无用的序列。

第五，  剩下，是有用的样本序列。

Ion Torrent 测序平台的特点

到目前为止，Thermo Lif公司在Ion Torrent平台上，推出了两款测序仪，小的叫PGM测序仪（Personal Genome Machine的意思），大的叫Proton测序仪。

Ion Torrent平台的主要测序优势，是可以从很少量的起始DNA来进行测序。一般情况下，5~10个ng的DNA就足够进行一次质量良好的测序了。

这个优势，是基于Thermo Life公司推出了一系列基于多重PCR的建库方案。

AmpliSeq是Ion Torrent平台上很好用的一个建库方案。它的核心，就是通过多重PCR的方法，一次从样本中把要测序的多个DNA片段给扩增出来，然后转化成文库进行测序。

ThermoLife公司基于其多年做PCR的经验，推出了这个AmpliSeq平台。在AmpliSeq平台上，一方面推出了许多成熟的测序Panel（，另外客户可以在AmpliSeq平台上，自行订制适合自己的AmpliSeq Panel。

所谓Panel就是一系列针客户感兴趣的基因片段，所做的扩增引物、或者杂交探针的组合。

有兴趣的同学，可以登录“www.ampliseq.com”这个网站，来寻求适合自己的测序服务。

Ion Torrent测序平台，一直有一个Homopolymer的问题。所谓Homopolymer问题，就是测序仪在测到一连串相同的碱基时，就读不准到底有几个碱基。比如说，有一串5个A，测序仪在读到这里的时侯，读到一个强的A信号，但是仪器在判断，这个信号到底是5个A，还是4个A、或者是6个A的时侯，有可能会判断错误。这就是我们所说的Homopolymer错误。

Thermo Life公司最近推出的了Hi-Q酶，这个Hi-Q酶的特点就是聚合反应非常快，也就是它所产生的PH值的变化的峰，更高、更尖、更利于判读。这在相当大程度上提高了Ion Torrent测序仪读Homopolymer区段时的准确性。

油包水PCR反应是一个对操作很敏感的实验步骤。为了提高实验结果的一致性，也为了减少人工消耗，Thermo Life公司还在Ion Torrent平台上推出半自动的油包水PCR反应仪：“One Touch”，和全自动的油包水PCR反应仪：“Ion Chef”

Ion Torrent平台的测序仪，还有一个优点，就是它的测序速度比较快。一般上机测序时间，在3~5个小时左右。

以上是本期视频的全部内容。

 

5. X10人全基因组测序

 

本期节目，我们主要给大家介绍：人全基因组测序。前半部分，我们会介绍一下Illumina 公司最新的HiSeq X10，这个专门用于人全基因组测的测序仪。那么后半部分呐，我们会给大家介绍一下人全基因组测序，将给出哪些有用的生物信息。

Illumina HiSeq X Ten

那么我们先来说一说，Illumina的HiSeq X10这个机器。这台仪器是Illuminad 2014年年头上，Illumina公司推出的一个重磅机器。它最吸引人们关注的特点，是它把测一个人全基因组90G数据量的成本，一下子降到了一千美元以下。

这台机器有以下的特点：

1、   首先，它测序的速度非常快，上它现在跑一圈、2张芯片，3天就跑完了。比之前的HiSeq 2000跑机器的时间—11，整整快出了2倍以上；

2、   第2点，就是它每张芯片的数据产量非常大，它的每张芯片的数据产量，可以达到0.9~1个T（10的12次方），甚至更多一些的数据产量。相比于HiSeq 2000每张芯片产0.3个T数据产量，又多出了2倍以上；

3、   第3点，是它的读长又增加了，它的读长从HiSeq 2000的双端（各）100个碱基，增加到现在的双端（各）150个碱基；

4、   最最重要的一点，还是测序成本的大幅下降。Illumina把HiSeq X10平均到每单位（G）数据量的、测序试剂的成本做了大幅的下调。根据Illumina公司自己公布的价格来看，测一个人全基因组90G的数据，它所需要的建库、和测序的试剂成本是797个美金。那么再加上一些人工、仪器折旧的直接成本，这样测一个人全基因90G的直接成本，已经降到1000美元以下。这就是它最大的吸引人的特点。

X10 的技术创新点      

X10这台测序仪，之所以可以把测一个全基因组的成本控制在1000美金以下，是因为采用了一系列的技术改进。

 

NanoWell技术

那么，第一项改进就是用了Nano Well技术。

Nano Well技术就是把原来测序芯片上平铺那2种引物，做成小孔。这些小孔整齐地呈蜂窝状排列，只在小孔的里面，才有长Cluster的引物，小孔之间的那些表面，是没有这些引物的。

这样的改进，所带来的好处：

第一个就是Cluster可以长得更密。

因为现在只有在小孔中有长cluster的引物，所以cluster也只能长在小孔中，原来这些cluster是在一个整个的表面上随机长的，那么必然会有些地方长得密，有些地方长得稀。那么那些长得稀的地方，它的表面实际上就是被浪费掉了。现在把所有的孔都排列起来之后，所有的表面都被充分地利用起来。根据Illumina的官方数据，X10的芯片上，它的表面的cluster密度可以达到一个平方毫米里面有120万个点，那么相对于HiSeq 2500每平方毫米60万个光点来说，那么它（X10的cluster密度）整整高出了一倍。这是第一个好处。

第二个好处，就是它更有利于扫描仪对cluster的判读。

那么原来的这些Cluster，长得就象天上的星星，是随机长的。这样扫描仪要判断Cluster，就需要有一个横向的对比，也就是一个cycle（循环）里面，4个光、4幅照片之间的对比。还要做纵向的对比，也就是不同cycle（循环）之间，要进行光点的对比。那么这样，对扫描仪的扫描精度高求很高，同时，又对服务器的计算，又提出了很高的通量要求。现在改成所有的格子，它的位置都是事先知道的，都是排整齐的。那么，对于光学扫描仪的扫描精确度的要求，就降低了。然后，它（扫描仪）的扫描速度，也可以提上去。

扫描完之后，对光点的空间位置的判断也变得容易，那么计算，也更加高效率了。

 

RPA技术

 

那么X10上的第2项改进，就是它的簇生成的技术，从原来的桥式PCR技术，改到了新的RPA技术。

那么RPA技术，是recombinant polymerase amplification的首字母缩写。

那么RPA技术，它是一种模拟自然条件下的DNA扩增技术。

我们知道PCR是用热来解链DNA的。那么RPA技术呐，不再靠热来解链DNA。它是用解链酶、和DNA单链稳定蛋白来把DNA的双链打开，然后再利用聚合酶来合成新DNA链。

RPA技术带来的第一个好处是，就是直接提升了小孔的利用效率。

如果还是用桥式PCR，那么在理想情况下，所有的孔当中，大概有约1/3的孔是单克隆的；还有1/3的孔，会是空克隆。还有1/3的孔，是多克隆。

那么空的孔、和多克隆的孔，都是没用的。

那么空的孔，因为当中没有数据。而多克隆的孔呐，当中的数据是乱的。所以，这两者都是没用的。只有单克隆的孔，是有用的。

那么因为限于泊松分布的这个原理，所以，桥式PCR的方法来做克隆，一般只有1/3的孔是有效的。

那么现在采用了RPA技术之后，它得到这样一个效果：就是这个测序的模扳，和小孔当中的引物的结合，是一个比较慢的过程。但是它一旦结合了之后，它就马上发生扩增。那么经过扩增之后，马上就把一个小孔给占满。

这样，这个小孔即使后面再有新的模板来，那么也无法发生新的扩增。因为已经被占满了。那么，这个有点象地铁上的抢座位，谁先抢到了，谁就坐。那么后来的人，就没位子了，只能站着。

那么，这个呢大大提高了小孔的利用效率。那么根据Illumina官方的数据，它的孔的利用率从原来的1/3，提高到了现在的60%、或者更高。

那么，RPA技术还带来了另外一项好处，就是它对于加入的模板的浓度（变化）的耐受性，更好了。那么现在它对加入的模板浓度（变化）的耐受性，扩大到了20%，而以前，一般只有5~10%的耐受范围。

更快的光学扫描

X10的第3项技术改进，就是用了更快的光学扫描仪。那么它的这个光学扫描速度，是原来HiSeq 2000的光学扫描仪的扫描速度的6倍。

对修饰dNTP更适应的酶

X10的第4项重要改进，是用了新版的酶。

 

因为在Illumina的测序过程中，用的dNTP并不是天然的dNTP，而是经过了修饰的dNTP。那么这个dNTP，主要有2个修饰。

第1个（修饰），在3’端的羟基上，它带了一个叠氮基团，这个基团，是可逆终止的化学基团，那么这是第1个修饰。

那么第2个（修饰），是在它的碱基上连出去一个长柄，长柄上，再接一个荧光基团。那么就是靠这个荧光基才的颜色，来判断这是哪个碱基。因为接这个荧光基团，所以它的碱基也不是个天然碱基，这是在dNTP上的修饰。

第2个，在边合成边测序过程中生成的这根新的DNA链，它不是个天然的链。因为每个循环结束之后，我们要用化学方法把那个荧光基团给切掉，但是这个切断的位置，并不是齐根的。也就是说每次切断之后，实际上，在这个碱基上还会延出去一个柄。所以，这根新合成的这个DNA链，并不是一个天然的DNA链。

那么这样呢，我们所用的这个聚合酶，它所面对的聚合的环境、和条件并不是天然的条件，它面对的是修饰过的dNTP，同时这个DNA链，也是一个带柄的这样一个DNA链。

那么，每次Illumina的测序技术有大的改进，都会要求这个酶有大的、新的突破，它所有的突破，就是说这个酶能够更好地耐受dNTP的修饰，和耐受这个DNA上的那个多出来的柄。同时，这个酶还要有很高的聚合活性。

那么我们看到，这次，Illumina在HiSeq X10上，它整个的化学速度提高了4倍，那么这个核心的提升，就是这个酶的活性更高。同时，这个酶对这些修饰和变化的耐受性更好了。这就是它的第4个重要改进。

在综合了上述几项重要的技术改进之后，X10测序仪就呈现出了今天我们所看到的这样强大的测序能力。

X10所测出来人全基因组数据能为我们带来的生物信息

在说完了X10的新技术、和强大功能之后，我们再来说一下，它所测出来的数据，能给我们提供什么样的生物信息。

SNP

首先，我们就要说一下，它所提供的SNP信息。

所谓的SNP，就是单核苷酸多态性，也就是Single Nucleotide Polymorphism。这个SNP指的是一个碱基的替换，比如：A变成T，或者G变成了T。这些，都叫SNP。

根据Macrogen公司所发表的30倍测序深度的X10的测序结果，在整个基因组中，98%的区域可以10倍以上的覆盖深度。

有了10倍以上的覆盖深度以后，来确认SNP信息，就相当可靠了。

同样Macrogen公司宣布的X10的测序结果，它所确认的SNP信息，与用HiSeq 2000所确认的SNP信息，互相的比对确认程度，高达到95%以上。这个，也说明X10的测序结果的可靠性是非常之高的。

那么在一般情况下，一个普通黄种人的基因组，与国际公认的、标准的HG19这个参考基因组序列相比，会有350万个左右的SNP。那么这350万个SNP当中，又有大概2万个是落在外显子上的。

而在这2万个落在外显子的SNP当中，非同义的SNP，有大概9千个。所谓非同义的SNP，也就是说这些SNP是会引起蛋白质的序列变化的。

Indel

X10测序数据所能提供的第2种生物信息，就是小片段的DNA插入、和缺失信息。我们通称称这种小片段的插入、缺失叫“Indel”。Indel是“Insertion”和“Deletion”两个英文词的合并缩写。

我们通常所说的Indel是指小于50个BP以内的微小的插入、和缺失突变。

那么Indel如果一旦落在外显子区域，它是一定会引起蛋白质序列变化的。如果它引起的是移码突变，那么在移码位点之后，所有氨基酸序列就和原来的序列完全不同了。

如果它（基因）还能保持原来的阅读框，也会引起蛋白质中若干个氨基酸的增或者减。

一个普通黄种人的基因组和标准的HG19参考基因组相比，约有50万个Indel。其中落在外显子上的，大概在1千个左右。

SV

X10测序数据所能提供的第3种信息，是基因组结构变异信息。我们通常称之为SV信息，也就是：Structure Variation信息。

它是指染色体的结构变异，常见的染色体结构变异，有以下几种：

1、   染色体内部的位移

 

2、   染色体之间的位移

 

3、   大片段的缺失

 

4、   大片段的插入

 

5、   大片倍的加倍

 

6、   大片段的倒位

 

CNV

X10测序（数据）所提供的第4种信息，是拷贝数变异信息。也就是CNV信息，Copy Number Variation信息。

它是指染色体片段的拷贝数变异。它包括拷贝数增加，也包括拷贝数减少。

实际上，CNV是和结构变异（也就是SV）紧密相关的。

结构变异中的大片段的增加、和大片段的缺失，会直接导致CNV的变化。

人全基因组测序，它对CNV是高度敏感的。这儿是一张图，来告诉我们：在全基因组测序当中，这些大片段的缺失和增加是可以被非常明确地给测出来的。

测序深度

这里，我们要说明一下，我们所说的，测90个G，或者测30倍的深度，对于测germline变异，也就是我们通常所说的“娘胎里带来的变异”，一般来说是够了。

因为一个人的基因，一半来自于爸爸，还有一半来自于妈妈。那么这两半，基本上是各占一半，所以，一个基因2个拷贝。每个拷贝，如果能够被测到5倍或者10倍，实际上做基因分型，是够了。

那么如果要测肿瘤，那是不够的。因为肿瘤的突变，是Somatic突变，也就是我们说的“体细胞突变”。

因为肿瘤细胞是和正常细胞混着长的，那么在肿瘤组织里面，正常细胞往往还占了大多数，肿瘤细胞往往只占一半、甚至更少一点。那么肿瘤细胞中的一个基因的2个拷贝，往往是1个发生了某种突变。所以，这个情况下，这个突变的基因，在整个这一群细胞当中占的比例会低于25%，甚至更低。甚至只有百分之几。

如果，这时候，测序只测30倍，是比较难于测到这些低频突变的。

那么为了要测到这些低频突变，这就要求我们对肿瘤要加大它的测序深度。那么，目前科研人员一般会对实体肿瘤进行50倍到100倍深度的（全基因组）测序。

同时，还会测一下病人血液中白细胞的基因组DNA（一般是测30X，90G）。那么，把这个白细胞的基因DNA作为正常背景，来做对照。然后，把肿瘤测出来的序列，和正常的对照，进行比对。来找出当中的突变。

还有一些科学家，会做另外一个选择，他会对肿瘤和血液白细胞的DNA，都做30X的（人全基因组）测序（目的是得到肿瘤CNV、SV信息），但是，他们会对肿瘤加测一个100X或者200X的外显子测序。

那么有了这些高深度的测序之后，我们才有比较大的把握，来捕捉到肿瘤中的那些低频的基因突变。

关于这4种突变，1、点突变；2、插入、缺失突变；3、结构变异；4、拷贝数变异，与肿瘤的发生有什么关系，大家可以在我的微信公众号【陈巍学基因】中回复“视频4”三个字，就可以看到我之前给大家做的，关于这方面的介绍视频了。

6. illumina 公司的Nano Well 测序技术

 

（Illumina公司）专利的微流体芯片是新的创新测序技术。极大地增加了数据的产量、和通量。让我们来仔细看一下此项新技术。

 

数十亿个纳米级的小孔按预先设定好的方式，整齐地排列。保证了DNA簇有固定的大小、和空间位置，使高密度芯片同时又有精确分辨率成为可能。

好处是数据产量大、有更多序列条数、和更快的仪器运行速度。

现在，你可以在更短的时间内处理更多样本。

这个流式芯片是用数十亿个有专利的Nano Well小孔，在玻璃基质上制作出来的。

在流式芯片生产好之后，只有在小孔中，才种有DNA引物。

 

在生成DNA簇的时候，新的、独家的扩增技术，保证一个小孔中，只有一个DNA模板，会与（小孔中的引物）结合，并形成簇。

当DNA模板与种子引物相结合时，它会立即快速扩增。这种快速的扩增，能防止别的DNA模板在同一个小孔中，形成“多克隆”。

 

 

这就保证了，在每一Nano Well小孔中，只形成来自一个模板的单克隆簇，这样做的结果，就是在大部分的小孔中，每个小孔都是来自于一个模板形成的DNA簇，当这种单模板簇形成好之后，流式芯片就可以做测序了。

测序过程是用行业内公认的、领先的、边合成边测序试剂来进行。

我们承诺：开发创新的测序解决方案，让突破性的发现成为可能，并释放基因组的（巨大）力量。

 

7.第一代DNA测序

 

本期节目，我们会谈一下：第一代DNA测序。

第一代测序，又称“Sanger”法测序，或者叫“双脱氧法”测序。

这是由美国生物化学家Frederick Sanger先生发明的，Sanger先生也因为此项发明，而获得诺贝尔奖。

ABI公司（现为ThermoFisher的一部分）在Sanger先生的双脱氧法的基础上，进一步开发出,荧光标记的双脱氧法测序试剂盒。也就是分子生物学界鼎鼎大名的BigDye 试剂。

接着，(ABI)再结合毛细管电泳，生产出了“ABI 3730”和“ABI 3500”等非常成功的测序仪。

到目前为止，ABI 3730、ABI 3500等测序仪和BigDye测序试剂，都是业内公认的一代测序的金标准。

今天，我们就以BigDye试剂为主线，来介绍一下，第一代测序方法的原理。

双脱氧法测序的第一个核心技术：就是在用DNA聚合酶合成DNA链的过程当中，掺入双脱氧核苷酸，也就是“ddNTP”，英文叫“Dideoxynucleotides”。

天然的DNA的组成元件是单脱氧核苷酸，也就是dNTP，deoxynucleotides。在其糖基的5’位、和3’位，各有一个羟基。5'位的羟基，连到上游的磷酸基团；3'位的羟基，连到下游的磷酸基团。这样不断重复，就形成了DNA的一条骨架链。

这就象一群人，其中每个人都伸出双手，左、右手，都各拉住一个伙伴，这样，就形成了一条长长的链。

Sanger的方法，就是用化学合成的办法合成出3’位没有羟基的核苷酸，也就是双脱氧核苷酸（ddNTP）。它比单脱氧核苷酸少了一个3’位的羟基，只保留了5'位的羟基。

它就象一个只有左手、但没有右手的独臂人，在聚合反应当中，它可以被聚合酶结合到DNA链当中去。因为它缺了3'位的羟基，所以它就没有办法和下一个dNTP结合了。DNA链的聚合反应也就此终止，不再往下延伸了。

 

这样，在DNA链聚合过程当中，通过掺有ddNTP的dNTP进行聚合反应，得到一系列不同长短的DNA片段。每个片段的3’位末端，都是一个双脱氧的核苷酸残基。并且这个核苷酸的残基，是与模板上对应位置的碱基互补的。

接下来，我们来说BigDye试剂的创新点。

它在双脱氧核苷酸（ddNTP）的基础上，再在碱基上，加上荧光发光基团，并且，A、G、C、T四种碱基各标一种颜色的发光基团。

有了不同颜色的荧光发光基团做标签，在最后的识别过程当中，就可以方便地通过颜色，就识别出这末端的双脱氧核苷酸碱基是哪种碱基。

在实际的测序中，先在反应体系当中，加入要测序的DNA模板。一般是经过纯化的质粒，或者经过纯化好的PCR扩增片段。

再加入与测序起始位置已知序列相互补的测序引物DNA，也就是primer。测序Primer在这里起的作用，是与模板的特定序列位置相结合，引导聚合反应发生。并且，它还可以确保：DNA的聚合反应，是从已知的、确定的起点开始。

然后，加入BigDye试剂，进行反应。

BigDye试剂当中，包括了刚才我们所说的“四种荧光标记的双脱氧核苷酸”、dNTP、和DNA聚合酶。另外，还包含了镁离子、PH缓冲液等。

反应过程当中，聚合酶从Primer处开始进行聚合反应。荧光标记的双脱氧核苷酸和天然dNTP，遵照碱基互补的原则，延着模板，一个、一个地被聚合到新合成的DNA链上去。

每聚合一个新的碱基，都有2种可能。

第一种可能，是结合进了一个正常的、与模板互补的dNTP。这时候，聚合反应就可以续继进行下去。

另外一种可能，是结合进一个与模板互补，但是双脱氧的、荧光标记的ddNTP。当DNA链中被结合进了一个ddNTP的时候，链的延伸就被终止。同时BigDye的荧光基团也就被加到这个DNA链的3'位末端。并且这个荧光基团的颜色，与模板对应位置的碱基种类，有对应的关系。

整个反应过程当中，产生了一系列、长长短短的、分别带有荧光标签的DNA片段混合物。

接着，这些DNA片段的混合物，经过一个简单的纯化，去掉游离的荧光ddNTP单核苷酸，留下有一定长度的DNA片段，就可以上机测序了。

上机测序过程当中，先在一根长长的、中空的玻璃毛细管当中，注入丙烯酰胺溶液。接着用紫外光照射丙烯酰胺溶液，丙烯酰胺在紫外线的电离作用下，发生聚合反应，变成聚丙烯酰胺凝胶。

在电场条件下，聚丙烯酰胺凝胶，对于在其中电泳的核酸，有分离作用。短的片段，在聚丙烯酰胺凝胶当中电泳得快；长的DNA片段，则电泳得慢。

然后，把DNA片段混合物，加到有聚丙烯酰胺凝胶的毛细管的一端。在毛细管的两端，加上高电压。DNA片段就在电场的作用下，从负极向正极电泳。

在毛细管的正极的末端，用激光进行照射，并用分光的光学传感器把不同颜色的荧光强度经记录下来。

每个DNA片段，在通过激光的扫描点时，它上面带有的荧光基团就会发出特定颜色的荧光。

因为在之前的聚合反应过程当中，聚合反应的起点都是从特定的引物位置开始的，所以越先电泳到达激光扫描点的DNA片段，就是越短的片段。它的聚合终止位置，离聚合的起始位置就越近。它所产生的荧光颜色，就反映了它3’端末端的那个碱基是A、C、G、T当中的哪一种。

那么反之，越慢电泳到达激光扫描点的DNA片段，就是越长的片段。它的终止位点，就离引物的起始位置越远。

然后，我们就得到了这样一种有四种颜色的图。

图的横轴是电泳的时间；纵轴是荧光的强度；4种颜色，则对应了4种碱基。

那么横轴既可以看作是电泳的时间，也可以看作是碱基的先后次序。

延着横轴，我们可以根据峰的颜色，判断出，依次是哪种碱基。

峰越高、越尖，与别的峰的交错越少，则这个碱基判读准确性越好。

上述，就是ABI公司BigDye测序方法的基本原理。

目前，用ABI 3500测序仪，一般可以测到850个碱基（长度），或者更长的片段的碱基序列。用ABI 3730（测序仪），一般可以测到700个碱基（长度），或者更长片段的序列。

以上是本期节目的全部内容。谢谢您的收看