IVD 免疫诊断之化学发光方法学 三大技术路径

引言

1 免疫分析技术发展史

电化学发光 (Electrochemiluminescence, ECL)，又称电致化学发光免疫(ECLIA)，是继放射免疫(RIA)、酶联免疫(ELISA)、时间分辨荧光免疫(TRFIA)、化学发光免疫(CLIA)测定以后的新一代标记免疫测定技术。 

 2 免疫分析技术发展的三代际划分

 3 当前国内外三大技术流派

 

分类	酶促化学发光		直接化学发光		电致化学发光
原理	用特定酶作为标记物，通过标记酶所催 化生成的产物作用于发光物质，以产生 化学发光，通过对发光强度的检测来进 行定量检测。		用化学发光剂直接标记抗原或 抗体，与待测标本中相应的抗体 或抗原结合后，加入发光促进剂 进行发光反应，通过对发光强度 的检测来进行定量检测。		电化学发光是电场参与化学发光 所产生的结果，是指通过施加一 定的电压进行电化学反应，通过 对发光强度的检测来进行定量检 测。
优势	灵敏度高，价格低		检测速度快		发光强度大，时间长
检测速度	辉光反应激发需要几分钟		3-5 秒		25 秒
光信号特点	辉光型 采用酶促反应后发出辉光方式发光 1.标记酶易受环境温度的影响，试剂 稳定性不如直接化学发光； 2.反应体系通常不能预先混匀， 3.发光持续时间短、发光强度微弱、 启停时间不可控、光信号分布不均匀 4.激光发光时间长、测试速度慢、一般需要数分钟		闪光型 采用瞬间发光方式发光 1.化学发光剂比酶类标记物更为稳定，不 受酸碱和温度影响，试剂保存期更长 2.反应体系通常不能预先混匀 3.发光持续时间短、发光强度微弱、 启停时间不可控、光信号分布不均匀 4.发光速度较快，反应体系简单		激发型 采用电激发光方式发光 1.激光发光过程复杂，每一个发光约为25秒 2.反应体系可充分混匀 3.具有发光持续时间长、发光强度大、 启停时间可控、光信号分布均匀的特点 4.能够稳定持续发光
发光与测量装置特点	采用管式发光及测量装置，为一次性， 可在一定程度上避免交叉污染		采用管式发光及测量装置，为一 次性，可在一定程度上避免交叉 污染		采用流通式电化学发光测量池， 控制发光及测量，可以重复使用， 环保性好。如处理不当，存在交 叉污染的可能
分离方法	常用磁微粒分离法、 微离子捕获法、包被珠分离法等		常用磁微粒分离技术		常用磁微粒分离技术
试剂稳定性	试剂含有酶，稳定性较差，不利于储存 和运输		试剂不含酶，较稳定		试剂不含酶，较稳定
发光标记物	辣根过氧化物酶 （HRP）	碱性磷酸酶(ALP)	吖啶酯	异鲁米诺(ABEI)	三联吡啶钌
底物/氧化剂	鲁米诺及其衍生物	金刚烷（AMPPD）	氢氧化钠-过氧化氢	氢氧化钠-过氧化氢	三丙胺（TPA）
原料特点	原料可获得，成本可控，大分子酶存在干扰问题		分子量低，背景干扰低、 检测灵敏度高、检测结果稳定	标记简单、成本较低， 易水解，稳定性较差	灵敏度高，但存在流动比色池交叉污 染问题循环及多次发光，检测限低范 围广，试剂稳定
国外厂家	强生	贝克曼、西门子	雅培、西门子	索林	罗氏
国内厂家	迈克生物、安图生物	迈瑞医疗	亚辉龙	新产业	普门、联众泰克

 

 

一、主流化学发光平台

1.直接化学发光（吖啶酯或吖啶磺酰胺）

吖啶酯、吖啶磺酰胺是直接化学发光的代表，无须催化直接发光。属于闪光型。四大家中雅培用的是吖啶磺酰胺，西门子Centaur系列用的是吖啶酯。

 （图片来自于网络）   

2.酶促化学发光

常见的酶促发光平台有辣根过氧化酶（HRP)、碱性磷酸酶（AP），这种发光是需要酶催化底物而产生光信号，而且光信号是辉光型。AP酶代表化学发光试剂厂家：贝克曼、迈瑞等，HRP代表厂家安图。深圳泰乐德医疗全自动化学发光免疫分析仪(VIT900)

 （图片来自于网络）

3.电化学发光

常见的是以三联吡啶钌标记抗体，以三丙胺（TPA）为电子供体，在电场中发生电子转移而发光化学发光反应。代表厂商就不用多说了，四大家中有罗氏，国内的厂商中有普门、联众泰克、安赛等。

 （图片来自于网络）

电化学发光高端但也相对小众，国内主流的仍然以吖啶酯（AE）和碱性磷酸酶（AP）两个发光平台为主。2019年底我们调研，AE和AP两个试剂厂家占比大概是50%：50%；到2022年底，我们再次的调研结果成了60%：40%。AE的“玩家”占了上风。现在到了2024年，AE的比例似乎更高了。

因为很多新进入发光领军的“玩家”都会选择AE平台。我们也问过一些客户他们选择AE发光平台的考量是什么，总结起来答案有两种：

1.这个工艺、方法比较简单；

2.成本比较低。

那AE、AP 这两种方法学的差异大吗？

下面，基于行业的一些经验，介绍吖啶酯（AE）和碱性磷酸酶（AP）两种发光的特点。

 

二、吖啶酯（AE）和碱性磷酸酶（AP）两种发光的特点

1.吖啶酯化学发光

国内最常用的吖啶酯或吖啶磺酰胺其实只有以下两种。

 

发光基理也差不多，如下图：

 

那么，吖啶酯（吖啶磺酰胺）化学发光的特点是什么？

• 标记相对简单——蛋白与吖啶酯（磺酰胺）直接孵育、透析即可

• 无需催化剂——碱性环境的H2O2即可直接激发发光

• 无需增强剂——本底低，信噪比高

• 双底物组分——需要预激发液和激发液

• 闪光型——发光信号持续时间很短，对发光仪要求高

但我们从一些文献中也获取到一些信息，比如西门子早期就做了大量的研究，他们研究了很多不同结构的吖啶酯对试剂性能的影响。

Analytical Biochemistry 406 (2010) 204–213 

研究表明，不同的项目或者说不同的抗体，最适合的吖啶酯（吖啶磺酰胺）的结构其实是不一样的。换句话说，要想让试剂达到最佳的性能，这个抗体连哪种结构的吖啶酯，是不是都要试一遍？据说，雅培内部也有各种各样结构的吖啶磺酰胺。所以，从这个角度来说，AE发光试剂的开发也不见得就简单。之所以觉得简单，可能我们还没有真正到人家的那个高度。

2.碱性磷酸酶化学发光

对于AP，其发光原理和吖啶酯完全不同。但不管是哪种底物，其原理可以理解为分成两步：第一步是底物A催化产生中间产物B，中间产物B分解成终产物C产生光信号。

 

从A到B的过程，所有底物一般都进行的很快，但从B到C，产生光信号的时间，不同的底物差别挺大。就拿AMPPD来说，从A到B特别快，但是从B到C很慢；而APS-5，从B到C能做到非常快，所以发光时间大大缩短。但越快的同时，稳定性可能会受到影响。

 

我们总结常见的AP底物的发光强度、发光时间和稳定性排序：

发光强度和发光时间：AMPPD<CDP-Star<APS-5

稳定性：APS-5<AMPPD<CDP-Star

所以，在AP的试剂体系中，有以下几个特点：

• AP与底物需要额外的时间，出结果的时间会长；

• 底物本身有一定的开发难度和额外成本；

我们在开发的试剂的过程中，也发现AP其实还有其他特点：

• 偶联标记工艺过程长，可能一次需要2天的时间；

• 但工艺比AE更加可控（AE偶联虽然简单，但容易受到温度等影响，而且有时候高浓度会有气溶胶污染）。

汇总一下，两个平台的优缺点如下图所示。优缺点都不少，其实没有完美的平台。

 很多人说，AE比AP有一点很大的优势，就是出结果的时间短。其实现在也不尽然，正如上面所述，AP搭配APS-5，也可以做到1分钟内的孵育时间，让出结果更快。

 

三、 电致化学发光ECL

详见：https://www.cnblogs.com/suntroop/articles/18701902