免疫组化染色原理
一、项目介绍
免疫组织化学IHC。
肿瘤一般流程,做HE常规染色,确认后进行针对性IHC检测分析。
不同项目的染色位置不同,分为:核染,膜染和浆染。
二、乳腺癌案例
三种成因,对应三种检测对象:
1.Her2,可采用罗氏靶向治疗药物赫塞丁针对性治疗。
2.ER,主要因激素等原因导致的乳腺癌,术后通过调节内分泌有效治疗方法。
3.PR,主要因激素等原因导致的乳腺癌,术后通过调节内分泌有效治疗方法。
4. 三阴,以上三种测试结果均为阴性的肿瘤,原因不详,可能与转移有关,严重程度高。
三、检测流程
1. 术后标本首先通过甲醛浸泡脱水,两方面:
1.1 防止细菌滋生使标本腐烂
1.2 防止组织细胞内酶渗透出细胞壁,破坏细胞形态。
2. 包埋,将标本用蜡包埋,便于保存和切割。
3. 切片,将组织切片,2~3微米,用于测试。
3.1 切片机包含手动和自动,手动切片机内部通过钢丝绕线,手动转动过程进行拉伸。提供2~5微米调节旋钮。
3.2 自动切片机,原理不详,不排除齿轮方案。只提供特定厚度切换。
4. 上机脱蜡,由于蜡侵入组织,反应试剂无法进入,因此必须先脱蜡后才能反应。
4.1 设置温度80度。
4.2 4分钟清洗一次,清洗过程为:加-吹-加。
4.3 由于溶解蜡的液体性能一般,需要多次清洗。
5. 抗原修复,甲醛固定时会将位点粘连,导致无法与一抗结合,因此需要将位点打开,使用抗原修复液高温修复。
5.1 高压锅方案温度达到121度左右,手工常规方式。
5.2 一般采用三种方式修复:化学方法,微波方法和加热方法。设备采用化学(抗原修复液和加热组合方式)
5.3 上机95摄氏度方案同121度方案偏差不大。
5.4 干片问题,如果出现干片,容易导致组织皱缩,影响最后的组织观察。
5.5 ER种类包括三种:PBS(缓冲液,ph7,磷酸盐成分,容易结晶且难以去除,可使用84消毒液或冰乙酸溶解,容易使长菌,5天左右可出现蓝-藻类、深色半点-霉菌)、CBS(ER1,ph6)、EDTA(ER2,ph9)
6. 添加ER过程中需要补液,由于抗原修复液中含有水和特殊物质,水沸点低,补液过程特殊物质浓度逐渐增加且残留在玻片上,因此需要pbs进行单独清洗。
7. 双氧水,修复后的组织上存在一些类源性过氧化物酶,该物质同HRP使DAB显色,影响判断,因此通过双氧水使之灭活。
8. 一抗,与组织上的抗原结合。
8.1 注:此时干片将导致一抗试剂附着在组织上,清洗步骤难以清洗导致非特异性显色。
8.2 由于一抗试剂量较少,控制时间和温度。20~30度。低于20度将减缓反应速度。温度过高(40或更高)将使期失活。
9 二抗、与已结合的一抗结合。
10. 三抗,一端与二抗结合,另外一段包含辣根HRP,能够使侵入的dab显色。
11. dab,将标记待测物(三抗),配置dab的成分为色源和双氧水,需要提前配置和充分搅拌。
11.1 对于大量dab配置时,可采用分层吸排的搅拌方案。
12. 苏木素,紫红色,用于对细胞形态进行染色。如果试剂环境存在温差(不能加热)将出现沉淀。
13. 返蓝,可通过加特殊试剂(或自来水冲洗,含氯),加速苏木素变色,变为天蓝色。便于显微镜观察。
14. 透明,使用酒精清洗将玻片中的水互溶,并蒸发带走,封片使用的中性树脂和二甲苯不溶于水,封片容易出现气泡和分层。影响观察。
15. 封片,加中性树脂和盖玻片。
三、试剂篇
脱蜡液:用于将组织上的蜡去除,腊熔点60度。
抗原修复液,用于将组织上被甲醛粘连的位点打开。
一抗:CD-3,在甲状腺肿B淋巴细胞,上包含该物质,将该物质打入小鼠体内产生抗体,作为CD-3一抗试剂。用于检测组织上是否存在CD-3。
二抗:一抗抗体,可以与一抗结合。作用:放大。
三抗:二抗抗体并携带用于激发DAB显色的HRP,可以与二抗结合。作用:放大和显色
DAB:染色液,被三抗激发显色。
苏木素:对细胞常规形态进行染色,原色紫红,反蓝后天蓝色。
酒精:透明,将组织上水分带走,避免封片时中性树脂和水不溶解产生气泡或隔层。