J Hazard Mater | 巴豆酰化修饰揭示环境污染对卵母细胞影响机制
景杰生物 | 报道
邻苯二甲酸二丁酯（DBP）是一种公认的内分泌干扰化学物质，已被美国环境保护署列为优先污染物。流行病学和动物研究表明，DBP暴露与女性各种生殖异常有关，包括子宫内膜异位症、早产、出生缺陷、发育毒性和致畸性。由于DBP能够通过胎盘屏障，研究人员前期发现DBP会影响发育的胎儿卵母细胞减数分裂前期I（MPI）过程 [1]，但是DBP对这一过程影响的具体分子机制及潜在的后果仍未能得到深入研究。 近日，重庆医科大学公共卫生学院何俊琳团队在国际知名期刊Journal of Hazardous Materials（IF = 14.224，中科院1区）上发表了题为”Maternal exposure to dibutyl phthalate regulates MSH6 crotonylation to impair homologous recombination in fetal oocytes”的最新研究成果 [2]。该工作通过巴豆酰化修饰组学研究了妊娠期间DBP暴露小鼠胎儿的卵巢组织，揭示了DBP暴露通过下调卵母细胞错配修复蛋白MSH6的巴豆酰化修饰以减弱其与Ku70的相互作用，进而启动对卵母细胞发育不利的非同源末端连接（NHEJ）修复的重要分子机制（Ku 是一种富集且普遍表达的胞核蛋白，能够结合 DNA 端粒或 DNA 双链断裂的末端，并使其稳定），该研究还报道了DBP暴露的影响会延续到多个子代的重要现象。景杰生物为该研究提供了蛋白质组学与巴豆酰化修饰组学技术支持。
1. 母体的DBP暴露导致胎儿卵巢的减数分裂缺陷研究首先研究了母体的DBP暴露对胎儿卵母细胞的影响，发现DBP的暴露会延缓减数分裂的进程。鉴于同源重组（HR）是MPI的重要事件，且这一事件是由DNA双链断裂（DSB）和后续的DNA损伤修复（DDR）所启动，因此研究者对DSB和DDR两个过程进行了研究。结果表明，DBP诱导DSB的累积（γ-H2AX水平升高，图1）以及HR过程抑制（重组酶的招募被破坏）。因此，DBP暴露诱导了严重的减数分裂缺陷，特别是DDR和HR过程受到严重干扰，然而这一观察结果与胎儿卵母细胞减数分裂DSB的有效修复并不一致，因此还需要进一步的研究。
图1. DBP暴露导致同源重组缺陷
2. 母体的DBP暴露改变胎儿卵巢的蛋白巴豆酰化修饰水平鉴于巴豆酰化修饰调控DNA损伤修复及精子生成，研究者决定探究巴豆酰化修饰在DBP暴露中的作用。巴豆酰化泛抗体杂交实验结果表明，DBP的暴露会显著抑制卵巢蛋白的巴豆酰化修饰。而后，利用基于质谱的巴豆酰化修饰组学，研究者发现显著的巴豆酰化修饰水平变化，其中375个蛋白的436个位点的修饰水平在DBP处理后出现了下降（另外有来自265个蛋白的397个位点修饰水平上调）。功能富集结果表明，发生修饰状态变化的蛋白参与到发育过程、染色质动力学、重组和DNA损伤修复过程。进一步构建了染色质和DNA损伤修复相关的蛋白网络，研究者在网络中的中心节点位置观察到了MSH6蛋白的存在。鉴于MSH6在DNA修复中具有重要作用，且已有报道MSH6的蛋白质翻译后修饰对其功能具有调节作用，因此研究者后续聚焦MSH6的巴豆酰化修饰在MPI中的生物学功能。
图2. DBP暴露胎儿卵巢的巴豆酰化定量蛋白质组学
3. DBP暴露下调MSH6的K544巴豆酰化修饰以破坏减数分裂重组通过MSH6的基因敲低实验和减数分裂过程的观察，研究者发现MSH6在调节胎儿的卵母细胞减数分裂中具有重要作用（MSH6的敲低导致减数分裂受损），且MSH6 敲低表现出与DBP暴露相似的结果趋势（图3），这提示了DBP诱导的减数分裂缺陷可能是由MSH6所介导的。而进一步的研究发现，MSH6的表达下降及DBP暴露会增强NHEJ的诱导蛋白表达，而使用NHEJ的抑制剂SCR7处理则可以挽救MSH6敲低或者DBP暴露引起的减数分裂抑制状态。因此，研究者推测DBP的暴露是通过影响胎儿卵母细胞的MSH6的功能以实现HR的抑制。
图3. MSH6敲低导致同源重组缺陷
之后，研究者先是对MSH6的蛋白表达水平进行了分析，发现其在DBP处理中并未发生表达变化，而其K544的巴豆酰化修饰水平则在DBP暴露组中出现显著的下调（0.466倍）。鉴于K544位于MSH6蛋白的表面，研究者推测其巴豆酰化修饰的变化可能会引起其与Ku70蛋白的相互结合。通过Co-IP实验，研究者发现了DBP处理减弱了MSH6与Ku70的相互作用，且基于抗体验证的结果表明MSH6的巴豆酰化修饰水平在DBP处理后同样发生了下降。随后，研究者构建了MSH6 K544突变体（MSH6 K544R，模拟其去巴豆酰化修饰状态），发现MSH6 K544R与Ku70的结合显著减弱（图4）。综上所述，K544位点的巴豆酰化修饰促进了MSH6与Ku70的结合，而DBP暴露则会抑制该MSH6 K544的修饰，减弱MSH6与Ku70的结合并促进Ku70的释放，进而激活NHEJ并抑制卵母细胞的减数分裂重组。
图4. MSH6的巴豆酰化修饰水平下降不利于其与Ku70的相互作用
4. 妊娠期的DBP暴露产生多代效应 鉴于NHEJ是一种容易发生错误的DSB修复途径，因此DBP的暴露引起的DNA损伤会导致胎儿在成年后发生生殖紊乱，并且由于它们的卵母细胞受损，其可能还会导致其子代的健康状态受到影响。通过对DBP暴露的母体（F0代）其子代F1以及F1的子代F2代进行观察，研究者发现DBP暴露会使得成年后的F1代母性行为发生变化，且其子代F2代的出生体重显著增加，同时还会出现早熟和焦虑感增强的症状（图5）。
图5. 妊娠期的DBP暴露对其子代影响显著
综上所述，该研究通过巴豆酰化修饰组学揭示了DBP暴露通过下调卵母细胞MSH6的巴豆酰化修饰以减弱与Ku70的相互作用，进而启动对早期卵母细胞发育不利的NHEJ修复的重要分子机制，此外，研究还报道了母体的DBP暴露影响会延续到多个子代的重要现象。该研究为DBP的合理使用和妊娠期母体的安全防护提供了重要参考。
图6. 本研究模式图
参考文献
1.Zhihan Tu, et al. 2019. Dibutyl phthalate exposure disrupts the progression of meiotic prophase I by interfering with homologous recombination in fetal mouse oocytes. Environmental Pollution.
2.Yidan Ma, et al. 2023. Maternal exposure to dibutyl phthalate regulates MSH6 crotonylation to impair homologous recombination in fetal oocytes. Journal of Hazardous Materials.
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