国金冲刺必看！手把手教你非组蛋白乳酸化修饰组学研究思路
乳酸作为体内的重要代谢物质，在生理以及病理过程中均发挥重要作用。2019年芝加哥大学赵英明教授研究团队在Nature上首次报道发现乳酸通过调控蛋白质的乳酸化修饰发挥调控作用，为乳酸的功能与机制研究打开了一扇全新的大门。
乳酸化修饰的系列探索揭示了其在生理/疾病过程中发挥的重要作用，不过乳酸化的早期研究主要聚焦在发生在组蛋白上的乳酸化修饰发挥的表观遗传作用。修饰组学的结果发现，除了组蛋白之外，存在非常大量的非组蛋白发生乳酸化修饰，并且这部分蛋白与生理和疾病相关的关键细胞过程相关。不过，目前对非组蛋白的乳酸化修饰及其下游的功能研究较少，还存在许多未知。
那么非组蛋白乳酸化修饰的研究如何开展？如何将其与课题方向和科学问题进行结合？今天小编以两篇典型的非组蛋白乳酸化修饰高分文章，为您介绍非组蛋白乳酸化修饰的两种研究思路，希望对您的研究有所帮助。
一. 以乳酸化修饰组学作为探索发现工具
文章标题：Lactylome analysis suggests lactylation-dependent mechanisms of metabolic adaptation in hepatocellular carcinom
发表期刊：Nature Metabolism
图1 该研究思路图
01 提出科学问题
肝细胞癌 (HCC) 是我国最常见的肝恶性肿瘤类型，复发率高且5年生存率较低。之前有研究表明翻译后修饰 (PTM) 组学的应用极大地促进了对HCC发病机理的理解和治疗靶点的鉴定。“Warburg效应” 是肿瘤的重要代谢特征，表现为糖酵解增强和乳酸堆积，乳酸作为乳酸化修饰底物，可以通过蛋白质乳酸化修饰 (Kla ) 的方式发挥重要的生物学功能。目前，Kla在HCC等癌症中的调控机制有待进一步研究。
02选择合适样本，进行乳酸化修饰组学
研究者收集了共110例HBV相关HCC患者 (复旦-Kla队列) 的手术切除肿瘤 (n=58) 和邻近肝脏样本 (n=52)。研究者对样本进行了深度蛋白质组学和乳酸化修饰组学检测，首次检测了肝细胞癌中乳酸化修饰组学，共鉴定到9140个蛋白质和9275个Kla位点。
图2 研究流程图
03分析数据，探索目标蛋白及关键修饰位点
数据全局分析：研究者通过对乳酸化修饰组学数据进行生物信息学分析，发现存在乳酸化修饰改变的蛋白主要参与细胞代谢和能量稳态调控等功能，表明乳酸化修饰对于HCC发生发展发挥全局性的调控作用。此外，整体乳酸化修饰水平与患者预后呈现显著负相关关系。
挑选关键蛋白：研究者通过生信分析发现参与ATP能量代谢通路的ATP代谢关键酶-腺苷酸激酶2 (AK2) 的蛋白表达水平显著下调，其乳酸化修饰水平则发生了显著上调。此外，AK2的蛋白水平与HCC患者的预后呈现正相关关系，但乳酸化修饰水平与HCC患者不良预后呈显著负相关。通过蛋白与蛋白相互作用分析，研究者进一步发现AK2 Kla水平与p53通路水平显著负相关，提示了AK2 Kla可能是通过调节p53通路导致HCC患者不良预后。
图3 乳酸化修饰蛋白广泛参与HCC的代谢相关途径
04 关键蛋白及修饰位点的功能研究
验证蛋白及修饰水平：AK2-K28位点位于ATP结合域，且在该研究中也通过质谱鉴定到了K28位的乳酸化修饰。作者围绕AK2-K28位点Kla开展了功能研究。首先，研究者使用乳酸/大剂量葡萄糖处理HepG2和Hep3B细胞，使用乳酸化修饰抗体发现细胞中AK2的Kla水平增加。研究者进一步检查K28是否是AK2的主要Kla位点，构建了AK2的K28R突变体，发现AK2的K28R突变导致乳酸和高剂量葡萄糖处理后细胞中Kla水平显著降低，表明乳酸化主要发生在高乳酸或葡萄糖环境中AK2的K28位。
最后，研究者检测了AK2-K28乳酸化修饰对于AK2蛋白活性的影响。研究者通过酶活性测定使用，发现K28R突变会降低AK2的酶活性，而且在包括K28Q，K28E和K28A在内的其他突变也观察到了类似的效果。且AK2酶活性丧失并证明其可导致能量紊乱，促进细胞增殖/迁移，进而促进HCC疾病进展。
图4 AK2-K28la降低AK2酶活性并导致HCC恶性肿瘤发生发展
05 思路总结
首先，研究者基于探索乳酸化修饰在HCC发生发展过程中的作用这一科学问题，选择了合适的样本进行了蛋白质组学以及乳酸化修饰组学检测。然后，研究者对乳酸化修饰数据进行了生信分析，探索HCC中发生乳酸化修饰差异蛋白在宏观上参与了细胞代谢、能量调节等信号通路。且基于肿瘤组织普遍存在能量代谢这一前提，进一步探索HCC组织中有哪些发生乳酸化修饰的蛋白参与了能量代谢，并将目光聚焦在AK2蛋白的K28位乳酸化修饰。最后，研究者借助抗体验证了HCC肿瘤组织中AK2蛋白K28位乳酸化修饰确实发生上调，也通过点突变等方式验证了AK2蛋白K28乳酸化修饰在HCC能量代谢紊乱、促进肿瘤细胞增殖、迁移等过程中发挥的重要功能。并提出AK2-K28La可能作为HCC治疗的潜在治疗靶点。
二. 乳酸化修饰组学作为验证目标蛋白功能的工具
文章标题：Mitochondrial pyruvate carrier 1 regulates fatty acid synthase lactylation and mediates treatment of nonalcoholic fatty liver disease
发表期刊：Hepatology
图1 研究思路总结
01 提出科学问题
随着肥胖、2型糖尿病和代谢综合征发病率的上升，非酒精性脂肪肝 (NAFLD) 的发病率也正在上升。之前的研究表明线粒体丙酮酸载体1 (MPC1)在NAFLD患者肝脏中上调，并与脂质沉积有关。关于MPC1对NAFLD肝脏脂质代谢的影响机制及其在NAFLD发展中的作用相关研究较为缺乏。基于此，作者运用了蛋白质、代谢组以及乳酸化修饰组学探索其背后机制。
图2 MPC1在NAFLD患者、小鼠肝脏和细胞模型中表达增加
02 通过蛋白组学/代谢组学探索MPC1对NAFLD的影响
研究者首先构建了MPC1基因敲除小鼠，然后对WT和MPC1+/-小鼠的肝脏进行了蛋白质组学研究，在蛋白表达层面探索MPC1对肝脏代谢影响。发现MPC1杂合子敲除改善了NAFLD中的肝脂沉积。但是蛋白质组学结果表明MPC1敲除并不改变脂质代谢中的关键蛋白表达，因此需要进一步探索MPC1调节脂质代谢的其他途径。此外，研究者基于WT和MPC1+/-小鼠血清的非靶向代谢组学分析发现MPC1基因敲除后小鼠血液中的乳酸水平显著升高。
图3 MPC1敲低后抑制脂质代谢，但不影响脂质代谢相关基因的表达
03 探索MPC1对于乳酸化修饰组影响，寻找关键蛋白FASN
乳酸作为乳酸化修饰底物，之前有较多研究报道乳酸可以通过乳酸化修饰方式影响蛋白功能进而影响疾病发生发展。因此，作者对WT和MPC1+/-小鼠的肝脏进行基于质谱的乳酸化修饰组学分析，共鉴定到528个蛋白和1526个修饰位点，其中39个蛋白上有47个乳酸化位点在MPC1基因敲除后发生了差异显著变化。研究者进一步通过生信分析发生乳酸化修饰存在差异的蛋白，发现调节脂肪酸从头合成的关键酶FASN的三个位点乳酸化修饰水平（K528、K673和K1071）在MPC1敲除后增加。
04 挑选FASN关键乳酸化修饰位点-K673
首先，研究者比较了FASN蛋白序列的同源性，发现残基K528和K673附近的序列在人和小鼠之间是同源的，这表明FASN在这些位点的乳酸化可能是保守的。此外，研究者对人FASN的结构进行了建模，发现K673位点与丙二酰辅酶A酰基转移酶（MAT）亚基（His683）的催化活性位点之间的空间距离相对较小，提出K673很可能会影响FASN活性。因此，研究者对于FASN-K673位乳酸化修饰进行进一步研究。
05 探索FASN-K673乳酸化修饰的功能
研究者通过点突变实验，将FASN蛋白673位K突变成T，模拟该位点的乳酸化修饰，探索该位点乳酸化对蛋白功能的影响。结果表明，FASN-K673T会降低FASN酶活性，改善肝细胞中的脂质沉积。研究者进一步通过FASN-K673R模拟该位点去乳酸化修饰，探索FASN乳酸化与MPC1之间的关系。结果表明，FASN-K673R可以通过增强FASN活性进而加剧MPC1缺失情况下的脂质沉积，表明FASN乳酸化在MPC1调节的脂质代谢中起重要作用。
图4 FASN K673乳酸化调节肝脏脂质沉积
06 思路总结
首先，研究者对WT以及MPC1+/-基因敲除小鼠肝脏进行了蛋白质组学以及代谢组学，探索了PMC1对于肝脏功能的影响。蛋白组学结果显示脂质代谢相关蛋白的表达水平在组间并无显著变化，但是代谢组学结果显示小鼠血液中乳酸水平升高。然后，研究者进一步对肝脏组织进行了乳酸化修饰组学分析，发现FASN的三个乳酸化位点（K528、K673和K1071）在MPC1敲除后增加。通过对蛋白序列的同源性进行分析以及FASN的结构建模，研究者选择了FASN-K673位点进行进一步研究。最后，通过点突变实验，研究者表明FASN乳酸化在MPC1的调节作用中起重要作用，K673是影响FASN活性的关键乳酸化位点。证明了MPC1在调节NAFLD肝脂代谢中的关键作用，并揭示了FASN乳酸化是一种新的作用机制。参考文献
1.QiangGao, et al. 2019, Integrated Proteogenomic Characterization of HBV-Related Hepatocellular Carcinoma. Cell.
2. Di Zhang, et al. 2019. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature.
3. Carlos Moreno-Yruela, et al., 2021. Class I Histone Deacetylases (HDAC1–3) are Histone Lysine Delactylases. Science Advances.
4. Zijian Yang, et al. 2023.Lactylome analysis suggests lactylation-dependent mechanisms of metabolic adaptation in hepatocellular carcinoma. Nature Metabolism.
5. Ruxin Gao, et al. 2022. Mitochondrial pyruvate carrier 1 regulates fatty acid synthase lactylation and mediates treatment of nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology.
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