从突变到新抗原：肿瘤与免疫系统之间的一场豪赌！
突变都有可能是“非同义突变（nonsynonymous mutations）”，会改变氨基酸编码序列，导致肿瘤细胞表达正常细胞所没有的异常蛋白。
这些异常蛋白，如果在细胞内（肿瘤细胞或APCs）被降解成短肽段（抗原表位），与MHC-I类或MHC-II类分子高亲和力结合，并以复合物形式呈递到细胞表面，被T细胞识别为“非己（non-self）”，引起T细胞活化，进而肿瘤细胞被效应T细胞攻击和清除（如图1）[2]。
这种会引起T细胞活化的异常蛋白即我们所称的“新抗原（neoantigen）”，能够产生新抗原的突变即为具有免疫原性的突变（immunogenic mutation）。
图1. 新抗原表位形成及被T细胞识别的过程
一方面肿瘤通过不断突变演变和进化；另一方面，恰恰是突变产生的新抗原触发了T细胞抗肿瘤免疫的开始（cancer-immune cycle的第1步，如图2）。
正是这种开始决定了肿瘤的免疫表型（Immune-desert tumor，Immune-excluded tumor，Inflamed- tumor），决定了肿瘤对某种免疫治疗的敏感性[3]。
肿瘤突变是随机概率事件，无法预测无法推算下一个突变是什么，这时肿瘤与免疫系统势必在进行一场豪赌：
随机突变，会不会有免疫原性？！
借用大叔的一句话：愿赌服输的决定就是“对”的决定
现在我们手里握着I-O治疗（PD-1/PD-L1抑制剂）的赌注，我们又该怎么去下这个赌注？这是一个非常困难的赌注，有太多因素影响着突变是否能够产生新抗原。从肿瘤的“底牌”（突变）去分析，会不会增加胜算？那么我们知道的有哪些？
图2. Cancer-immune cycle and Cancer-immune setpoint
1.突变数量
基于全基因组，全外显子或target panel测序，我们已经可以知道肿瘤基因组去除胚系突变（germline mutation）后的体细胞突变数量（somatic mutation），即肿瘤突变负荷（tumor mutation burden, TMB）。
一般以肿瘤非同义突变总数量或每1Mb（1兆碱基）的突变数量来表示，10/1Mb的突变相当于肿瘤基因组编码区含有150个非同义突变[4]。然而，其中只有10%的非同义突变可以产生与MHC高亲和力结合的突变肽段[3]。而能够与MHC高亲和力结合的肽段又只有1%能够被肿瘤患者体内的T细胞识别[5]。也就是说150个非同义突变，最终可能也只产生1-2个新抗原。
虽然，从突变到产生新抗原，每一步都有很大折损，但理论上:
TMB越高，最后能够被T细胞识别的新抗原产生也越多。
基于此，以我们非常熟知的每种肿瘤TMB来分析（图3）赌注：
TMB>10/1Mb的黑色素瘤，经常会产生新抗原（frequently），对PD-1/PD-L1抑制剂敏感，这是黑色素瘤对PD-1/PD-L1抑制剂效果更好的原因之一；
很大一部分肿瘤TMB> 1/1Mb，< 10/Mb，能够产生新抗原（regularly），对PD-1/PD-L1抑制剂可能敏感，有些需要联合治疗来增加新抗原的产生。例如在临床上，不经过筛选，确实也看到了NSCLC一部分患者对PD-1/PD-L1抑制剂有效；
而肿瘤TMB<1/Mb，几乎不太可能产生新抗原（occasionally），对PD-1/PD-L1抑制剂不敏感。
研究发现，TMB越高，确实肿瘤部位免疫杀伤活性越大（图4）[6]。临床研究的数据也表明多个瘤种PD-1/PD-L1抑制剂治疗ORR确实与TMB成正相关（图5）[2]。
图3. 肿瘤TMB及产生新抗原的可能性
图4. 肿瘤TMB与免疫杀伤活性的关系
图5. 肿瘤TMB与ORR的关系
2.突变类型
基于TMB数量的分析，我们会提高赌注的胜算，但不会完胜，因为像上述的并不是所有的非同义突变都会产生被T细胞识别的新抗原。
某些新抗原具有免疫优势，免疫系统会对这些新抗原“念念不忘”，而忽略掉另外一些新抗原[4]。如果知道某种突变类型与新抗原存在必然关联，那么我们的赌注可能会接近完胜。
不幸的是，每个肿瘤突变产生的新抗原几乎是独一无二的存在[7]。在~20,000个黑色素瘤中发现了20种新抗原，但是不同肿瘤个体出现相同新抗原在的概率非常低（图6）[8]。虽然看到这样的结果很沮丧，但我们依然能够寻找到一些规律和提示：
图6. 相同新抗原出现在不同个体的概率
2.1 驱动突变很少产生新抗原
驱动突变形成新抗原是最理想的状态，因为同一个肿瘤内几乎所有肿瘤细胞都具这种突变，如果产生新抗原，那么针对新抗原的T细胞能消灭大部分肿瘤细胞。
可惜的是，驱动突变很少产生新抗原，在~20,000个黑色素瘤中发现的20种新抗原，只有8%的新抗原来自驱动突变，而92%的新抗原来自非驱动突变（passenger mutation）（图7）[4]。这也是EGFR突变患者PD-1/PD-L1抑制剂疗效没有野生型患者好的原因之一：
TMB低，且EGFR突变本身不能产生新抗原。而KRAS突变患者却中了“彩票”，KRAS G12D突变能够产生与HLA-C*08:02高亲和力结合的新抗原，而被T细胞识别（图8）[9,10]。
而且，KRAS G12D突变产生的新抗原也不是独一无二仅出现在个别突变患者体内，已经发现同1种新抗原会重复出现在多个突变患者体内[7]。KRAS突变对PD-1/PD-L1抑制剂敏感更重要原因可能是能够产生新抗原，并非单纯是TMB高。KRAS突变类型与HLA结合的亲和力，及能不能定性预测PD-1/PD-L1抑制剂敏感性值得深入研究。
图7. 驱动突变和非驱动突变产生新抗原的比例
图8. KRAS G12D突变产生新抗原及被T细胞消灭的过程
2.2 与原编码序列差异越明显的突变越容易产生被T细胞识别的新抗原：
突变与原编码序列差异越明显，产生异常蛋白外源性即“非己”特征越明显，免疫原性越强。
肿瘤突变中95%的突变是点突变（substitutions），其余包括插入/删除突变（insertion/deletion），或移码突变（frame shift）[3,11]。很明显，插入/删除及移码突变导致氨基酸序列和空间结构改变会比较大，与MHC分子结合的亲和力会更强，被T细胞识别为新抗原的可能性越大（图9）[3]。
在黑色素瘤的研究发现，某些对CTLA-4抑制剂持续应答的患者新抗原具有共同保守的4肽序列表位，与病原体序列非常相似，易于被T细胞识别，这可能是黑色素瘤患者对免疫检查点抑制敏感的真正原因，而不是单纯的TMB高。
只是TMB越高，出现4肽序列表位的可能性越高[12]。这个时候我们回过头来想想，是不是只关注了各瘤种TMB高低那张图的上半部分，却忽略了下半部——各瘤种的突变类型完全不一样（图10）。基于突变类型的分析，是不是赌注的胜算会更大？
图9. 突变类型与免疫原性
图10. 肿瘤TMB及突变类型特征
虽然有很多未知，但我们对肿瘤突变的“底牌”，从数量到类型的了解会越来越清晰，我们可以测序知道所有会产生异常蛋白的突变；我们可以演算能与MHC分子高亲和力结合的肽段；我们可以检测这些肽段被T细胞识别的可能性；我们可以结合液体活检（ctDNA/CTC）动态监测突变的动态变化，预测耐药；甚至最终我们不再祈祷肿瘤患者像中了彩票一样有免疫原性突变，我们可以通过联合治疗增加或输入新抗原。我们越来越接近真相，免疫治疗这个赌注的胜算也越来越大。
【参考文献】
1.Hanahan D,Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell 2011;144:646-74.
2.YarchoanM, Johnson BA, 3rd, Lutz ER, Laheru DA, Jaffee EM. Targeting neoantigens toaugment antitumour immunity. Nature reviews Cancer 2017.
3.Chen DS,Mellman I. Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point. Nature2017;541:321-30.
4.SchumacherTN, Schreiber RD. Neoantigens in cancer immunotherapy. Science 2015;348:69-74.
5.KristensenVN. The Antigenicity of the Tumor Cell - Context Matters. The New Englandjournal of medicine 2017;376:491-3.
6.Rooney MS,Shukla SA, Wu CJ, Getz G, Hacohen N. Molecular and genetic properties of tumorsassociated with local immune cytolytic activity. Cell 2015;160:48-61.
7.Tran E,Robbins PF, Rosenberg SA. 'Final common pathway' of human cancer immunotherapy:targeting random somatic mutations. Nature immunology 2017;18:255-62.
8.Forbes SA,Beare D, Gunasekaran P, et al. COSMIC: exploring the world's knowledge ofsomatic mutations in human cancer. Nucleic Acids Res 2015;43:D805-11.
9.Tran E,Robbins PF, Lu YC, et al. T-Cell Transfer Therapy Targeting Mutant KRAS inCancer. The New England journal of medicine 2016;375:2255-62.
10.June CH.Drugging the Undruggable Ras - Immunotherapy to the Rescue? The New Englandjournal of medicine 2016;375:2286-9.
11.VogelsteinB, Papadopoulos N, Velculescu VE, Zhou S, Diaz LA, Jr., Kinzler KW. Cancergenome landscapes. Science 2013;339:1546-58.
12.Snyder A,Makarov V, Merghoub T, et al. Genetic Basis for Clinical Response to CTLA-4Blockade in Melanoma. The New England journal of medicine 2014.
13.LawrenceMS, Stojanov P, Polak P, et al. Mutational heterogeneity in cancer and thesearch for new cancer-associated genes. Nature 2013;499:214-8.
