生物（选必三）
发酵工程
少女祈祷中……
细胞工程
植物组织培养
将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在培养基上，给予合适条件，诱导形成完整植株。
原理：植物细胞的全能性。（产生完整植株或分化出其他各种细胞的潜能）
考点：细胞变成植株体现植物细胞的全能性，种子变成植株没有体现，因为不是一种细胞。
植物细胞具有全能性原因：细胞有该植物全部遗传信息。（全部遗传信息：植物只需要一个染色体组，动物需要全套）。
全能性表现条件：
- 完整细胞结构。
- 离体状态。
- 一定营养。激素等条件。
外植体：离体培养的植物器官、组织、细胞。（一般取花药或幼嫩部位，如茎叶）（花药组培得到为单倍体，秋水仙素处理，低温诱导）
培养非花药部位：外植体 \(\to\)（脱分化） 愈伤组织 \(\to\)（再分化） 根、芽或胚状体 \(\to\) 完整植株
脱分化不需要光照，再分化需要光照。
再分化需要植物激素：生长素和细胞分裂素比例影响根芽生成。
- 生长素多利于根分化
- 细胞分裂素多利于芽分化
- 适中促进愈伤组织生长。
- 记忆：生根发（分）芽。
胚状体：未经过受精，但是经过胚胎发育过程形成的胚状类似物。一般专指组织培养条件下产生的非合字胚。
附：秋水仙素抑制纺锤体形成，染色体加倍，作用在幼苗上，低温诱导。
实验操作
- 制备 \(\text{MS}\) 固体培养基（因为是固体，所以要在 \(\text{MS}\) 培养基加琼脂。）
- \(\text{MS}\) 培养基加蔗糖：提供营养，调节渗透压。（不能换成葡萄糖，因为同质量渗透压大，植物不易吸水，且植物吸收蔗糖较慢，渗透压更稳定）。
- 需要高压蒸汽灭菌法灭菌。
- 外植体消毒（幼嫩茎段）：流水冲洗，酒精 \(30\text s\)，无菌水 \(2\sim3\) 次，次氯酸钠 \(30\min\) 后，立即用无菌水 \(2\sim3\) 次。
- 接种：
- 置于无菌培养皿，无菌滤纸吸水，切成 \(0.5\sim1\text{cm}\) 小段。
- 酒精灯火焰旁， \(\dfrac1 3\sim \dfrac1 2\) 插入诱导组织的培养基中，用封口膜或瓶盖封盖瓶口，标记。
- 培养：在 \(18\sim22^\circ\text C\) 培养箱，定期观察。
- 转接 \(15\sim20\ \text{days}\) 后，转接到新培养基，先生芽的，再生根的。（因为根转接容易损坏，所以先芽）
- 移栽：先开盖生长几日，流水洗根，移植到消毒蛭石或珍珠岩，，长壮后移栽入土。
植物体细胞杂交技术
概念：不同种植物体细胞，融合成杂种细胞，并培育成新植物体。
原理：细胞膜具有一定的流动性，植物细胞具有全能性。
优点：打破生殖隔离，实现远缘杂交育种。
- 温和条件下（较高/等渗透压），用纤维素酶和果胶酶，去掉细胞壁。（较高渗透压，因为可以把膜和壁分开）
- 植物体细胞原生质体融合方法：必须人工诱导
- 物理法：电融合法，离心法等。
- 化学法：聚乙二醇（\(\text{PEG}\)）融合法，高 \(\text{Ca}^{2+}-\) 高 \(\text{pH}\) 融合法。
- 融合完成标志：再生出新的细胞壁。（通过染色体条数等筛选）
- 植物体细胞杂交的终点：形成杂种植株。
附：原生质体比原生质层多了液泡中的细胞液。
植物细胞工程应用
应用：利用植物组织培养技术，快速繁殖优良品种。
优点：无性繁殖，保持优良品种遗传特性，材料少，周期短，繁殖率高，便于自动化管理。
应用：作物脱毒，选病毒极少甚至无病毒的部分（如茎尖），组织培养，再生植物就可能不带病毒。
应用：人工种子（人工薄膜包装人工胚乳和胚状体或不定芽、顶芽、叶芽等）
优点：保持优良特性；生产不受气候、地域等限制；方便储存运输；解决某些作物难产生后代的问题。
应用：植物产物工厂化生产。
优点：快，量大，又不破坏植物。
作物新品种培育
方法：花药离体培养
优点：明显缩短育种年限；稳定遗传；都是纯合体。
突变体利用：
- 培养中一直分裂，容易受培养条件或诱变因素（射线等）产生突变，筛选有用的，培育。
- 偶然突变的可以组织培养稳定遗传。
转基因植物培养
植物体细胞杂交
动物组织培养
- 把组织剪碎，用胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）分散成单个细胞。（消化）（不能胃蛋白酶，因为胃蛋白酶在低 \(\text{pH}\) 才有活性）
- 一段时间后加入一定培养液终止消化，离心，吸走上清液，留下下部，拿新鲜培养液加入，制成细胞悬液。
- 能悬浮生长的在培养液中生长增殖，需要贴壁的细胞贴培养瓶生长。（要求表面光滑、无毒、易贴附）（接触抑制：贴壁生长的生长一层后会停止分裂增殖，癌细胞除外）
原代培养，第一瓶；传代，分瓶后。
实验取 \(10\) 代内细胞比较好，遗传物质无改变。
获得细胞群：
- 无毒无菌环境：培养液加一定抗生素；定期更换培养液。
- 全面营养物质：水、无机盐、糖、蛋白质、促生长因子、微量元素等；通常加入血清、血浆等天然成分。
- 适宜 \(\text{pH}\) 和温度：哺乳多 \(36.5\pm0.5^\circ\text C\)，多数细胞 \(\text{pH}\ 7.2\sim7.4\)
- 气体环境：\(95\%\) 空气（不是 \(\text O_2\)）和 \(5\%\text{CO}_2\)，\(\text{CO}_2\) 主要作用为维持 \(\text{pH}\)。
附：抗生素抑制细菌，干扰素抑制病毒。
干细胞培养应用
分类：胚胎干细胞（全能干细胞，能发育成个体）、成体干细胞（专能干细胞，不能发育成个体）等。
医疗应用：
- 造血干细胞：恢复病人造血和免疫功能。
- 神经干细胞：治疗神经损伤，神经系统退行。（帕金森，阿尔兹海默）
- 诱导多能干细胞（简称 \(\text{iPS}\)：诱导细胞形成类似胚胎干细胞的细胞。（没有免疫排斥的器官移植等）
动物细胞融合技术
诱导方法：\(\text{PEG}\)（聚乙二醇）融合法、电融合法、灭活病毒融合法。
意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。
应用：单克隆抗体。
单克隆抗体
优点：特异性强、灵敏度高、可大量制备。
作用：
- 作为诊断剂。
- 运载药物，靶向治疗肿瘤等。
单一细胞系产生的抗体叫做单克隆抗体，简称单抗。
原理：一个 \(\text B\) 细胞在抗原刺激下产生一种特异性抗体，骨髓瘤细胞可以无限增殖，两个细胞杂交成的杂交瘤细胞，既能迅速大量增殖又能产生单一抗体。
制备：
- 特定抗原注射到小鼠体内，从免疫器官内得到 \(\text B\) 淋巴细胞。
- 融合，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出产生所需抗体的杂交瘤细胞。（放到多孔板上，尽量一个孔一个细胞，克隆化培养后，取上清液与特定抗原测试。
- 培养：体外培养，在培养液中提取抗体；或在小鼠体内培养，从小鼠腹水中提取。
动物细胞核移植技术
一个细胞核移入一个去细胞核的卵母细胞，变成新胚胎，发育为个体。
原理：动物细胞核的全能性（比植物加一个“核”）
过程：
- 卵母细胞培育到减二中期，去核（纺锤体和染色质的混合物）。
- 供体细胞培养后，直接整个注入卵母细胞。
- 电融合法融合，得到重构胚。
- 物理或化学方法激活重构胚。
- 转移到代孕动物体内。
- 生出个体。
克隆动物为何和供体像但是不完全一样：细胞质中遗传物质来源于卵母细胞；生物性状表达受环境因素影响。
选卵细胞做受体细胞原因：
- 体积大，易操作。
- 卵黄多，为发育提供充足营养。
- 减二中期卵母细胞有促进细胞核性全能表达的物质。
应用：
- 家畜遗传改良。
- 保护濒危物种。
- 医药卫生。
动物胚胎工程
体外受精。胚胎移植、胚胎分割。
正常受精前：
- 精子获能：精子必须在雌性动物生殖道内发生相应变化后才能受精。
- 卵子：在输卵管内进一步成熟，到减二才能受精。
受精时：
- 精子穿过放射冠和透明带。（精子顶体放出酶以穿过；同时，透明带反应，防止其他精细胞进入）（第一道屏障）
- 进入卵细胞膜，同时卵细胞膜反应。（第二道屏障）
- 原核形成。（雄的核膜破裂，雌的受刺激进行减数分裂，排出第二极体）
- 彼此靠近，核膜消失，形成合子。
受精标志（考点）：卵黄膜和透明带间出现两个极体。
受精完成标志（考点）：雌、雄原核结合。
胚胎发育过程：
- 卵裂期。
- 桑葚胚：都是全能细胞。
- 囊胚：内细胞团未分化，外部分化出滋养层细胞，出现囊胚腔。
- 原肠胚：进一步分化为三个胚层，有原肠腔。
体外受精：人工模拟体内环境；精子获能常用肝素或钙离子载体。
胚胎移植
移植入生理状态相同的其他雌性动物体中。（需要同期发情）
生物学基础：
- 早期胚胎为游离状态，可以收集。
- 子宫对外来胚胎基本不免疫排斥。
过程：同期发情，超数排卵，受精收集，培养移植，检查妊娠，生下幼崽。（桑葚胚、囊胚阶段移植）
使供体母牛超熟排卵：用促性腺激素。
意义：充分发挥雌性优良个体繁殖潜力，大大缩短供体本身繁育周期。（这样供体可以在本该怀孕的阶段继续产生卵子）
胚胎分割技术
材料选择：桑葚胚或囊胚。（如果是囊胚，需要内细胞团均等分割）
具体操作：用分割针或分割刀将细胞切开，吸出半个胚胎，注入预先准备的透明带，或直接移植。
意义：
- 产生性状相同的后代，是遗传学研究的宝贵材料。
- 在胚胎移植前进行性别鉴定，遗传病筛查等。（取滋养层）
基因工程
实质是：基因重组。（基因重新组合）
基因重组：
- 减一前期：交叉互换。
- 减一后期：自由组合。
限制性内切核酸酶（限制酶）
来源：主要从原核生物中分离纯化。
功能：识别双链 \(\text{DNA}\) 分子特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位磷酸二酯键断开。
\(\text{DNA}\) 链接酶：链接两段双链 \(\text{DNA}\)，恢复被限制酶切断的磷酸二酯键。（\(\text E\cdot\text{coli}\ \text{DNA}\) 链接酶只能链粘性末端，\(\text T_4\text{DNA}\) 链接酶两种都能连）
运载体：
