[生命科学] 生物基础实验之三引物检测突变体
三引物检测转基因植物
Ti质粒和T-DNA
Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒,该质粒上有一段特殊的DNA区段,当农杆菌侵染植物细胞时,该DNA区段能自发转移,插入植物染色体DNA中,Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。人们根据这一现象,将Ti质粒进行改造,将感兴趣的基因放进T-DNA区段中,通过农杆菌侵染植物细胞,实现外源基因对植物的遗传转化。
设计引物
PCR方法为鉴定纯合突变体提供了有利手段。它利用三个引物LP、RP和BP,其中LP和RP是植物基因组上T-DNA插入位点两测的引物,BP是T-DNA区段上的引物。打开网站http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html。在白色方框处输入T-DNA编号即可获得两端引物。
中间引物通常是通用的,如我要验证的基因是SAIL_1238_XXX,中间引物则是SAIL)。然后把得到的信息发送给公司。收到的引物如图:
离心管中引物为粉末状,非常细小。因此,我们拿到引物后需要离心1分钟,即可看到轻微沉淀。再按离心管上要求,图2左侧显示加51x10μL的buffer或者超纯水,右侧引物显示加48X10μL的buffer或者超纯水(一般我们会稀释10倍)。放入-20℃冰箱冷冻保存。图3可以看到离心管盖子上分别标记了LP和RP,防止操作错误。
原理
T-DNA本身的长度约为17kb,而两端的引物本身长度为小于100bp,因此插入之后会阻抑两端引物的扩增产物的形成。如果,LP和RP这对两端的引物能扩出来,说明中间引物没有插入进去,该植株为野生型(wt),由于野生型不包含目的基因,因此BP和RP也无法扩出PCR。如果LP和RP两端引物不能扩增出来,但BP和RP能扩增出来,则说明该位点插入成功,为纯合基因型(aa)。如果两端引物能扩增出来,且中间引物与末端引物也能扩增出来条带,说明该基因型为杂合基因型(Aa)。为什么是中间引物和反向引物扩增?因为DNA序列是有方向的。如正向引物往右边,反向引物往左边,中间引物方向为右,因次中间引物只能与反向引物进行扩增。因此,利用以上三种引物做PCR,根据扩增结果能够很容易地从群体中区分出纯合突变体。
LP+RP | BP+RP | 说明 | |
---|---|---|---|
野生型 | 有大片段 | 无 | BP为中间引物 |
杂合型 | 有大片段 | 有小片段 | LP为正向引物 |
纯合型 | 无 | 有小片段 | RP为反向引物 |
实验步骤
实验主要分为两个部分:DNA的提取和PCR扩增(参考之前发表实验方法)。
这里需要注意的是(1)在提取植物DNA时,如果某一批种子播种较多,可以进行混叶检测。例如:每个基因型的种子种植物20株,为了检测这一批次基因,可以将20个单株叶片都取一点混合到同一个离心管提取DNA,得到的结果更具有说服力。(2)在PCR扩增实验,实验试剂包括7.5μLMaster Mix 溶液,5.5μL蒸馏水,引物各0.5μL以及1μL 模板(植物的DNA)。或者是5μLMaster Mix 溶液,引物各0.5μL以及4μL模板。
在实际操作过程中,我们很难准确将0.5μL的引物提取出来。因此,在样品数较大的情况下,我们可以先混合溶液。比如我们需要验证10个植物突变体,也就是说一共需要提取0.5*10=5μL。这样既方便我们提取溶液,加快速度,又能减少误差,保证准确性。
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