文献分析 scNT-seq

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https://www.nature.com/articles/s41592-020-0935-4.pdf

 

摘要

区分单个细胞中新生的mRNA和之前就存在的mRNA

有效地标记新转录的具有 T 到 C 替换的 mRNA。

 

 

	Progress	Challenge	Demand
Background	要研究不同细胞基因表达的动态情况	普通scRNA技术捕获的是新旧mRNA混合的结果，无法解析RNA动力学
	传统区分新旧RNA的方式为，利用外源性核苷类似物进行RNA代谢标记（4sU），然后再对标记的RNA进行生化富集； 4su = 4-thiouridine = 4-硫尿苷	问题：需要样本量大？富集的效果？
	又有一些方法是将4sU换成胞苷类似物，替换的结果是尿嘧啶U-胞嘧啶C的替换，这样的方法不需要生化富集
	已有研究开发出将单细胞技术（smartseq）与上述标记技术相结合，也就是RNA代谢测序	通量低，成本高；没有UMI，无法定量新生转录本水平
Solve	What	How	Effect
	scNT-seq a high-throughput and UMI-based scRNA-seq method	结合RNA代谢标记，微流控，将 4sU 重新编码为胞嘧啶类似物，以同时测量来自同一细胞的新旧转录组	对细胞 RNA 动力学进行时间分辨分析
Result	Development and validation of scNT-seq. 1.通过4sU代谢标记，4sU会在转录过程中替换U的角色，但凡在标记后新生成了RNA，都会标记上4sU 2.在逆转录之间将4sU处理为C*类似物 最终的结果是测序结果中出现了T-to-C的转换
	1.Development and validation of scNT-seq. 2.Evaluating scNT-seq performance for detecting activity-induced new RNAs. 3.Identification of neuronal activity-induced, time-resolved regulon activity. 新旧转录本转录因子的调控活性 SCENIC 4.Metabolic labeling-based time-resolved RNA velocity analysis.    基于代谢标记的RNA速率 dynamo 5.scNT-seq reveals distinct RNA regulatory strategies during stem cell-state transition. 为研究罕见瞬时细胞群的RNA调控策略 多能 - 中间 - 全能C2样（调控机制不清楚）
Conclusion& Discussion
	Read alignment and quantification of metabolically labeled transcripts. 每个细胞中高质量的reads取出来，通过UMI分组 仅保留质量值大于27的TC转换 背景的TC转换需要根据对照组的数据得到再减去 但凡发现TC转换的UMI就是新生的了
Method	Estimation of the fraction of newly synthesized transcripts.  基于二项分布混合模型 二项分布模拟的是每个基因转录本T-to-C发生的数量 其中θ是新生转录本的比例，pq是新旧转录本TC替换发生在每个核苷酸的概率 ni是U碱基在转录本i中的观察值