文献分析 PseudotimeDE: inference of differential gene expression along cell pseudotime with well-calibrated p-values from single-cell RNA sequencing data

原文pdf连接： https://genomebiology.biomedcentral.com/track/pdf/10.1186/s13059-021-02341-y.pdf

 

摘要：

为了研究细胞状态变化的分子机制，一个关键的分析是沿着从单细胞 RNA 测序数据推断的拟时间识别差异表达 (DE) 基因。然而，现有方法没有考虑拟时间推理的不确定性，并且它们具有无效 p 值或限制性模型。在这里，我们提出了 PseudotimeDE，这是一种适用于各种拟时间推理方法的 DE 基因识别方法，考虑了拟时间推理的不确定性，并输出了经过良好校准的 p 值。综合模拟和真实数据应用验证 PseudotimeDE 在错误发现率控制和功率方面优于现有方法。

 

	Progress	Challenge	demand
background	scRNA-seq
	Pseudotime inference,differentially expressed (DE)
	已有的方法：TSCAN [10], Slingshot [11], Monocle [8], and Monocle2 都是先提供了轨迹分析，再提供差异检验 都是通过generalized additive model拟合基因变化	不支持外部导入的拟时间数据
	目前有两个方法支持导入的数据： tradeSeq （NB-GAM）其 p 值计算基于卡方分布，这是对零分布的不准确近似。因此，其 p 值缺乏正确的概率解释。 Monocle3  generalized linear model (GLM) GLM 比 GAM 更具限制性，因为 GLM 假设细胞中基因counts计数的对数变换是细胞伪时间的严格线性函数，这通常是不对的。	以上方法都没有考虑拟时间的不确定性； 要知道，细胞的拟时间没有置信区间； 不确定性导致无效的p-value，无法FDR矫正
	除了以上方法，还有一些是处理连续时间点bulk数据的； NBAMSeq： NB-GAM + Bayesian shrinkage method in DESeq2 类似 tradeSeq  ImpulseDE2：“impulse” model，单细胞的性能未被充分评估
solve	what	how	effect
	PseudotimeDE： 适用于用户输入的拟时间数据， 考虑拟时间的随机性， 输出经过良好校准的 p 值	通过抽样估计拟时间的不确定性， 将不确定性纳入DE基因分析	确保了FDR矫正的可靠，以及其他下游分析，避免由于过于保守的 p 值而导致的不必要的性能损失。
result	Overview of the PseudotimeDE method four major steps: subsampling, pseudotime inference, model fitting, and hypothesis testing 1.subsampling，每次抽样80%细胞 2.pseudotime inference， 原始数据也推断，抽样也推断；通过每个抽样的细胞重排得到0假设 3.model fitting，原始数据中的每个基因拟合NB-GAM or zero-inflated negative binomial GAM (ZINB-GAM)。 4.hypothesis testing，对于每个基因，拟合重排的抽样，得到检验统计量的0值；用每个基因的检验统计量和0值比较得到p-value 所谓检验统计两就是推断的拟时间对基因表达的影响大小，通过拟合自然得到。
	Simulations verify that PseudotimeDE outperforms existing methods in the validity of p-values and the identification power p值的有效性   dyntoy模拟不同离散程度和分支的单细胞数据 构建拟时间的方法为Slingshot and Monocle3-PI 拟时间推断具有“线性不确定性”：在一个分支内的不确定性，不同方法线性不确定性不同 拟时间推断具有“拓扑结构不确定性”：不同抽样的结构不同，不同方法识别结构的性能不同   比较方法：PseudotimeDE，tradeSeq, Monocle3-DE, NBAMSeq, and ImpulseDE2   比较p值的有效性：0假设下p值应均匀分布在0-1 特别是在小p值情况下表现也比较好： 比较鉴定差异基因的能力 比较了所有五种方法在实际5%的错误发现比例下的能力 以上比较 PseudotimeDE 均最佳
	Real data example 1: dendritic cells stimulated with lipopolysaccharide compare PseudotimeDE with tradeSeq and Monocle3-DE LPS刺激后的小鼠树突状细胞 (DC)数据 p值双峰分布使得鉴定差异的能力降低 PseudotimeDE 特异性的差异基因的GO分析发现，它找到的基因与实际更相符 总之，我们的功能分析验证了PseudotimeDE识别出tradeSeq和Monocle3-DE遗漏的具有生物学意义的DE基因，证实了PseudotimeDE除了具有良好校准的p值外还具有高效率。
	Real data example 2: pancreatic beta cell maturation PseudotimeDE识别具与实际意义相符合的差异基因 bulk RNA DE 基因在 PseudotimeDE 发现的排名靠前的 DE 基因中最为丰富。 Slc39a10 为已知的变异基因，Sst为已知的不变基因，比较实际效果：
	Real data example 3: bone marrow differentiation 除了p值的排序，p值的标称值对于GSEA等下游分析也很关键。因此，经过良好校准的 p 值使 PseudotimeDE 优于现有的 DE 基因鉴定和下游分析方法。
	Real data example 4: natural killer T cell subtypes 多分支的情况，逐个分支检验， PseudotimeDE 最优
	Real data example 5: cell cycle phases 提前确定数据的真实差异基因和非差异基因 用各种方法与实际基因比较 我们得出结论，PseudotimeDE 在从这个 iPSC scRNA-seq 数据集中识别细胞周期相关基因方面优于 tradeSeq 和 Monocle3-DE。
	Computational time 1.计算前过滤低质量基因 2.减少抽样次数：>=100
Conclusion& Discussion	-
method	-