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2023年11月27日 Debug还是得靠自己,别人的建议仅供参考。 LR做了最少4遍,都没有靠谱的克隆出现。 一开始以为是Plasmid里RNA含量太高,稀释了DNA的含量,加了足量的Plasmid也不顶用。 只能去所用试剂的官网里找答案了:Gateway™ LR Clonase™ II Enzy 阅读全文
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载体病毒的质量至关重要,如果活性太弱,那DNA、RNA等就无法被被成功递送到细胞内,整个系统就不会工作了。 所以很多细胞基因治疗方案的瓶颈就在于载体。 在实验室里,我们一般用Lentivirus,其容量大、活性高、整合到genome表达稳定。 Lentivirus最好是现做现用,因为lab prot 阅读全文
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Co-IP全称Co-Immunoprecipitation,中文学名免疫共沉淀,是一种以抗体和抗原识别专一性为基础,用于研究蛋白质之间相互作用的经典方法。 通俗点来说,假设我们需要研究样品中A蛋白和B蛋白之间是否存在一些相互作用,首先我们通过合适的方法处理样本,将蛋白提取出来(同时不能破坏蛋白之间的 阅读全文
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ConSurf-StandAlone https://github.com/leezx/ConSurf-StandAlone /home/zz950/tmpData/consurf 如果对特定的fragment感兴趣,可以去做MSA,https://www.uniprot.org/uniprotkb 阅读全文
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参考前篇:可变剪切 | isoform | PSI | 单细胞 | suppa | salmon salmon的定量是不基于序列比对的 Salmon基因定量是一种常用于RNA测序(RNA-seq)数据分析的方法,其原理是利用贝叶斯统计模型从RNA-seq reads中预测不同转录本或基因的表达量。 阅读全文
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Tips: Atlas级别的数据,需要做加速处理,比如常见的marker鉴定,不要用seurat默认的函数,非常慢。 presto包的算法复杂度极低,再大的数据基本一分钟内就能出结果。 markers_rna <- presto:::wilcoxauc.Seurat(X = all.colon, g 阅读全文
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目前在做GI的Atlas项目,主要分为三类细胞:epithelial,stromal,immune。 其中epithelial就是cancer cell,然后TME就是stromal和immune。 最出名的TME就是CAF和TAM。 Key stromal cells include cancer 阅读全文
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这是最传统的细胞生物学手段,首先构建一个mouse的in vivo模型,然后就是切片,然后染色,直接用眼睛看,在顶刊上经常能看到一些非常漂亮的彩图,既美观又真实。 在医院里,这一类被叫做pathologist,通常就是医生初步诊断后,然后就靠pathologist来做分子诊断,IHC,然后基因型检测 阅读全文
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流式细胞仪的cell sorting是很多细胞和分子生物实验的基础,比如单细胞测序、细胞周期等。 Flow cytometry and cell sorting are two distinct yet complementary techniques. Both rely on antibodie 阅读全文
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镇楼综述: Best practices for single-cell analysis across modalities - Nature Reviews Genetics - 2023 (https://www.sc-best-practices.org/preamble.html) 最新的 阅读全文
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值得思考的问题: 为什么抗体类药物(20-27%)的研发成功率高于小分子药物(5-10%)?毒性和有效性 为什么抗体类药物与靶点结合能力弱,但反而治疗效果更佳? 小分子和抗体类药物的耐药性机制有何不同? 研究证实,西妥昔单抗与EGFR的结合能力要弱于小分子抑制剂吉非替尼与EGFR的结合能力,但有数据 阅读全文
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2023年07月24日 你不可能真正成功,如果你不知道什么叫做失败!【做实验尤其如此】 接下来的两个week,我将开始疯狂的cloning各种工具,常见的CRISPR ko/i/a都要玩一遍。 克隆的大致流程是一样的,就是要设计不同gRNA,所用的Plasmid也是不一样的,lentivirus克隆 阅读全文
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问题很简单,我有一段目标oligos(常见的就是gRNA,shRNA),如何最高效精准的克隆到我的目标质粒Plasmid里。 1.最常规的ligation 2.之前的CRISRP KO gRNA用的是Golden Gate Assembly NEBridge® Golden Gate Assembl 阅读全文
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实验的图最好还是用传统的Graphpad Prism来做,这样整个style可以看着更专业一些。 非要用ggplot来做也可以,就是不那么美观。 最经典的qRT-PCR需要做成柱状图。 参考: /Users/zhixinli/Dropbox (Partners HealthCare)/Project 阅读全文
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属于几大functional assays中的一个: Negative-selection competition assay CTG - proliferation colony formation assay cell cycle xenograft 如果你要深入研究一个oncogene或者TS 阅读全文
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目录: 临床: 消化道的具体结构?小肠、大肠、结肠、直肠的概念?CRC的左侧和右侧的差别? 什么是polyps、lesion、tumor、cancer,这之间的区别是什么?Nonneoplastic、Neoplastic;adenomas and serrated 什么是CRC,临床上如何界定?在各 阅读全文
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非常火的一个由DFCI开发的药物系统,原理就是蛋白降解,在实验室里就在目标蛋白后面加一个尾巴,它会连接到泛素化降解系统,从而降解目标蛋白。 dragging a protein of interest (POI) to a E3 ligase for degradation like dTAGv1, 阅读全文
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2023年07月05日 分析单细胞数据已有5年的经验,但竟然没有从头生成过自己的数据。 小鼠基本是机制类探索项目的必备实验,不需要太复杂,只要简单的杂交取样即可。 小鼠模型: Aberrant cell state plasticity mediated by developmental repro 阅读全文
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前作 转录相关signalling pathway活性打分 | 常见打分系统 | PROGENy 基于基因表达的打分模型 几种常见的打分方法: mean,最简单 PercentageFeatureSet Seurat的AddModuleScore,多了一个背景基因集,消除背景的影响,没什么意义,相当 阅读全文
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2023年09月06日 比较一下CRISPR和shRNA,我还是喜欢可诱导的shRNA,主要原因就在于其可控性。 从常识就知道:在你敲除一个基因以后,细胞会随着时间发生一系列的动态变化的,如果基因十分重要,那么最终细胞会死亡,抑或达到一种稳态。 目前我们实验室还没有可诱导的CRISPR质粒,所以在L 阅读全文