mRNA基本概念
mRNA是由DNA的一条链转录而来的(可以是正链,也可以是反链),DNA是由非编码区和编码区组成,编码区也有其特殊的结构,主要有外显子和内含子组成。
mRNA的一个重要性质就是可变剪切,也就是同一个编码区,可能会有不同的外显子组合。
mRNA的结构:5’端的帽子结构和3’端的polyA尾巴。
polyA和oligo(dT)是什么?它在mRNA纯化和反转录中有什么作用?
传统mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)是根据绝大多数真核细胞mRNA3'端具有的多 聚腺苷酸尾(polyA)结构,因此可用含oligo(dT)的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。该方法的创始人Liang P和Pardee A根据Poly A序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征,设计合成了12种下游引物,称3′-锚定引物,其通式为5'-T11MN;同时为扩增出polyA 上游500bp以内所有可能性的mRNA序列,在5′端又设计了20种10bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的 DNA条带,其中每一条都代表一种特定mRNA种,这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。将差别表达条带中的DNA回 收,扩增至所需含量,进行Southernblot或Northernblot或直接测序,从而对差异条带鉴定分析,以便最终获得差异表达的目的基因。