ZFNs | TALEN | CRISPR | 基因编辑
问题：
- 三代基因编辑的技术特点是什么？具体机制是什么？技术起源？
- DSB和DSR是什么？核酸酶发挥着什么作用？
- CRISPR是如何在细菌中发现的？细菌是如何实现自我免疫的？有哪些关键元件？spacer DNA是什么？crDNA是什么？
- 理解CRISPR的每一个词是什么意思
- CRISPR是如何被改造，被我们利用的？什么是Cas9？什么是gRNA，什么是PAM sequence？
- CRISPR目前发展到什么地步了，有哪些核心的衍生技术？
- base editing和prime editing区别？
- 真核细胞是染色质，为什么也能被编辑？
一代：zinc-finger nucleases (ZFNs)，锌指核酸酶
二代：transcription activator-like effector nucleases (TALENs)，转录激活因子样效应核酸酶
三代：clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)–Cas-associated nucleases，成簇的 规则 间隔 短 回文 重复序列 (CRISPR)–Cas 相关核酸酶
Targeted DNA alterations begin from the generation of nuclease-induced double-stranded breaks (DSBs), which leads to the stimulation of highly efficient recombination mechanisms of cellular DNA in mammalian cells.
核酸酶诱导的双链断裂 DSB
细胞DNA的高效重组机制
- homology-directed repair (HDR) 同源定向修复 - targeted integration（donor DNA insertion）- 应用：mutation correction or new sequence insertion
- nonhomologous end-joining (NHEJ) 非同源末端连接 - gene disruptions （deletion or insertion）- 应用：mRNA degradation or nonfunctional truncated protein production by nonsense-mediated decay
homologous recombination (HR) 效率低，所以：
靶向核酸酶被发现作为提高 HDR （DSB）介导的遗传改变效率的替代方法
一旦制成了靶向 DSB，HDR 就可以使用与断裂位点序列类似的外源 DNA 模板来重建切割的 DNA
ZFNs：这些核酸酶系统需要专门的能力来生成由可定制的序列特异性 DNA 结合域组成的人工蛋白质，每个域都连接到非特异性核酸酶以进行靶标切割
TALENs：基于 TALE 的可编程核酸酶可以以相对较高的频率切割任何感兴趣的 DNA 序列，缺点：为每个新的 DNA 靶标设计复杂的分子克隆及其在成功靶向细胞中的基因组筛选效率低
CRISPR/Cas9：RNA-guided DNA cleavage module，其中CRISPR是，Cas9是核酸酶，从基因组序列校正或改变 到 表观遗传和转录修饰，CRISPR起源：bacterial adaptive immune defense system 细菌适应性免疫防御系统
三种技术对比：
| ZFNs | TALENs | CRISPR/Cas9 | |
| 识别位点 | Zinc-finger protein | RVD tandem repeat region of TALE protein | 单链guide RNA |
| 修改模式 | Fok1核酸酶 | Fok1核酸酶 | Cas9核酸酶 |
| 目标序列大小 | ZFN单体9–18 bp，ZFN对18–36 bp | 14–20 bp / 28–40 bp | 20 bp gRNA + PAM sequence |
| 特异性 | 容忍少量错位匹配 | 容忍少量错位匹配 | 容忍位置/多个连续不匹配 |
| 靶向局限性 | non-G-rich sites难 | 5ʹ 目标碱基必须是 T | 目标位点必须位于 PAM 序列之前 |
| 工程化难点 | 需要大量的蛋白质工程 | 需要复杂的分子克隆方法 | 使用标准克隆程序和寡核苷酸合成 |
| 运送难点 | 相对容易，因为 ZFN 表达元件的小尺寸适用于各种病毒载体 | 由于功能组件尺寸大而困难 | 中等，因为常用的 SpCas9 较大，可能会导致 AAV 等病毒载体的包装问题，但存在较小的直向同源物 |
问题：
- 什么是PAM序列？
- 如果容许错配，那脱靶效应怎么控制？
- TALEN为什么需要分子克隆？
目前对基因组编辑的临床前研究主要集中在病毒感染、心血管疾病 (CVD)、代谢紊乱、免疫系统的主要缺陷、血友病、肌肉萎缩症和基于 T 细胞的抗癌免疫疗法的开发。
clustered
regularly
interspaced
short
palindromic
repeat
参考：
- What is CRISPR? - YT - 通俗科普视频
- Applications of genome editing technology in the targeted therapy of human diseases: mechanisms, advances and prospects - Signal Transduction and Targeted Therapy – 2020
2007年，一家酸奶公司发现一种细菌拥有抵御病毒的特殊防御机制。2012年，细菌的这种机制就被科学家阐述清楚，2013年这一领域快速增长。它被视为分子生物学的一个奇迹，事实上，它并非仅对生物学家产生革命的影响，这个世界同样也会随之而改变。这就是基于CRISPR系统的基因编辑技术。
早在2012年和2013年，《科学》杂志就已将CRISPR纳入到年度10大科学发现的榜单中，不过它属于陪跑“角色”。随着近些年来一系列的重要科学发现，CRISPR基因编辑技术备受注目，其中最重要的两项研究是：修饰物种的基因，以减少其数量或减少其携带的疾病（如蚊子等），以及人类胚胎细胞的基因组编辑，它们的出现都给现有的科学秩序提出严重挑战。胚人类胚胎细胞基因修饰工作由中山大学学者完成，该研究亦成为12月份在华盛顿召开的国际人类基因编辑峰会（International Summiton Human Gene Editing）的一个重要导火索。
基因编辑技术其实并不很新鲜，胎细胞基因修饰工作由中山大学学者完成，该研究亦成为12月份在华盛顿召开的国际人类基因编辑峰会（International Summiton Human Gene Editing）的一个重要导火索。
基因编辑技术其实并不很新鲜，此前的技术有ZFN和TALENs。目前已经有几家公司利用基因编辑技术用于临床治疗，相比去前面两项技术，CRISPR基因编辑技术简单很多，以至于“每个分子生物实验室都在想做CRIPSR基因编辑技术”。非营利组织Addgene，目前已经发布了50000种质粒，这是一种环状的DNA，里面包含CRISPR系统中两种关键的部件：向导RNA（Guide RNA），能与特殊DNA片段结合；另外一个重要组分是DNA剪切酶，通常将其称为Cas9。CRISPR系统的最早发现者之一、加州伯克利分校的分子生物学家Jennifer Doudna表示，“它就像PCR技术，一个潜藏在工具箱里的工具”。CRISPR系统拥有如此强大的能力，以至于科学家很容易地创造出基因型完全不同的生命体。
