蛋白质定量技术 | Mass Spectrometry | LC-MS/MS | CyTOF | RIME | 单细胞蛋白组测序

 

名词解释：

  • LC-MS - Liquid chromatography–mass spectrometry 液相色谱-质谱联用仪
  • CyTOF - Cytometry by time of flight - 质谱流式细胞技术
  • RIME - Rapid Immunoprecipitation Mass spectrometry of Endogenous proteins（内源性蛋白质的快速免疫沉淀质谱）

combines the separating power of liquid chromatography（色谱分离） with the highly sensitive and selective mass analysis capability of triple quadrupole mass spectrometry（质谱质量分析）.

质谱流式细胞技术（mass cytometry，MC）就是将电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）应用到单个细胞的分析，原理是用纯化的单元素同位素标记抗体，然后使用ICP-MS检测该元素离子峰。 该技术融合了流式细胞分选仪和ICP-MS。

 

 

蛋白质技术是我的技能黑洞，就做过简单的分析（MS结果的log2FC），甚至连相关的技术和概念都搞不清楚，该恶补一下了。

先说说我们在用的蛋白组学技术，低通量的WB，co-IP对实验来说已经够用了，那什么时候才上高通量呢？

一般都是上RNA-seq做genome-wide的筛，然后用WB来验证。

 

应用一：找到一个核心的因子，如TF，SOX9，需要筛选与其互作（C或者N端）的蛋白。

方法就是用co-IP的protocol，然后做Mass Spectrometry

IP-MS

Cdx2_td_IP-Sx9_A
Cdx2_td_IP-Sx9_B
Cdx2_ApcKO_IP-Sx9_A
Cdx2_ApcKO_IP-Sx9_B

Harvard Medical School - Taplin Mass Spectrometry Facility

每个样品里大概有六种数值结果：

  • reference
  • Gene Symbol
  • Unique
  • Total
  • Sum Intensity
  • Intensity%

其中核心的就是Sum Intensity，最终也是根据这个得到相对的表达。因为数值很大，所以根据每组里面的最低表达Min做了一个fold change。

Proteomics:

Mass spectrometry raw spectra from each experiment are processed and searched using the Sequest1 HT search engine within the Proteome Discoverer 2.2 (PD2.2, Thermo), to obtain relative protein quantitation and protein identification profiles. Identified peptides are filtered for maximum 1% false discovery rate (FDR) using the Percolator algorithm in PD 2.2. The intensity values of peptides, which are summed from the intensities values of the number of peptide spectrum matches (PSMs), are summed to represent the abundance of the proteins. DEqMS2, which takes into account the inherent dependence of protein variance on the number of PSMs or peptides, is used to perform differential protein expression analysis, and generate log2 fold change (Log2FC) and P-value of protein expression between two groups. The resulting P-value is adjusted using the Benjamini and Hochberg approach for controlling the false discovery rate (FDR). Proteins with an adjusted P-value < 0.05 and absolute(Log2FC) > 1 are assigned as differentially expressed.

 

免疫共沉淀（Co-IP）与质谱结合的技术路线（CoIP-MS）是目前研究蛋白互作的主流技术。

一个重要假设是：实验样本在温和的非变性条件下裂解，不破坏相互作用的前提下提取内源性蛋白。【co-IP考虑了所有情况，推理非常solid，几乎不存在漏洞】

Co-IP实验反映的是两个蛋白在体内或细胞水平的相互作用。在进行Co-IP检测时，样本一般源于非变性裂解细胞，活细胞状态下蛋白质之间的相互作用被保持，所以反映的是细胞中真实的蛋白互作情况。

但是，诱饵蛋白和靶标蛋白之间是否是直接作用，或者是否有其它蛋白介导，是无法确定的。【无法判断直接还是间接互作，但根据条带的强弱可以推理出来】

 

Co-IP实验要点：

  • 需要特异性IP级别诱饵蛋白抗体；【非常依赖抗体的特异性，以及目标蛋白的表达水平】
  • 如果没有特异性抗体，需要考虑构建重组标签质粒，用标签抗体进行CoIP实验；
  • 样品种类实验风险：过表达细胞样品<细胞样品<动物组织样品；
  • CoIP-MS风险：由于存在特异性抗体高丰度蛋白，质谱不一定能够鉴定到诱饵蛋白。【我们的数据确实检测不出诱饵蛋白，不理解这里的解释】

 

也可以用于检测两组样品间的蛋白（如histone）的修饰差异

To define the impact of chemical disruption of HDAC1/2 on global chromatin and epigenetic regulation, we performed histone (H2, H3 and H4) PTM profiling by mass spectrometry using the Proteomics group at the Broad institute (Malvina Papanastasiou). After histone specific immuno-precipitation, we interrogated 79 different PTMs including (methylation, acetylation (ac), and ubiquitinylation) in two CRC lines treated with MRK60 and iMRK60 (data from one cell line shown in Figure 11). 

 

RIME - RIME（内源性蛋白质的快速免疫沉淀质谱）

识别转录共因子和染色质相关蛋白

非常依赖neg control的设置：【直接把所有的假阴性都过滤掉了】

  1. V5-GFP
  2. V5-SOX9 dox-
  3. V5-SOX9 dox+ 【唯一pos】
  4. V5-SOX9Δc

通过内源蛋白的快速免疫沉淀质谱分析（RIME）来表征HIF2A所占据的核复合物，其中，PAX8为HIF2A核相互作用组的成员之一。在同时与HIF2A和PAX8组成的复合物中的89个蛋白为染色质重塑（SWI/SNF复合物）或mRNA加工等过程中具有功能的核蛋白。对异种移植的ccRCC肿瘤的ChIP-seq分析也显示HIF2A和PAX8在染色质上共定位的高频率，简而言之，786-M1A和OS-LM1肿瘤中分别有43%和65%的HIF2A结合位点显示出显着的PAX8结合。

RIME（Rapid Immunoprecipitation Mass spectrometry of Endogenous proteins）是一项 ChIP 和质谱分析相结合的技术。非常适合用于鉴定转录辅助因子和染色质相关蛋白的相互作用。传统的鉴定蛋白相互作用的方法是 IP 之后进行质谱分析。与 IP 方法不同，RIME 使用的起始材料经过交联，主要检测的是染色质上蛋白之间的相互作用。

 

参考：

 

应用二：CyTOF中通量肿瘤免疫微环境单细胞分析

如果只是检测某几个蛋白，普通的流式细胞术就能满足需要，但是由于细胞的代谢流变化迅速且牵涉较多的代谢调控基因和酶，那普通的流式就显得有心无力了。质谱流式技术是一种多维度的单细胞分析技术，可用于蛋白或 RNA 的多因子检测。从 2009 年发表至今，目前质谱流式技术可检测 130 个因子，远远多于荧光流式技术可检测的 30 种因子。

质谱流式数据包含所有被测细胞方方面面的信息，是地地道道的高维数据；这种数据的复杂性实际上是组织细胞本身异质性的忠实写照。获得这些数据后，科研人员首先想了解的其实就是组织的亚群构成情况。

CyTOF质谱流式的结果应该相当于单细胞转录组数据，只是特征变成了蛋白的表达，但维度没有转录组高，就只有100多个蛋白。

质谱流式在信号通路的磷酸化蛋白的检测中表现卓越【不仅限于蛋白表达，还有蛋白的修饰，是信号转导的核心】

 

案例：

为了寻找irAE-n的癌症患者中的特异性免疫细胞亚群，研究人员通过质谱流式（CyTOF）分析来自34例irAE-n患者和49名没有irAE-n的对照患者的外周血样本，总共检测分析了48个蛋白靶标。

CyTOF发现与irAE-n相关的T细胞谱、先天免疫亚群和B细胞谱。

有病人样本就能做，应该比单细胞测序便宜，因为维度低，所以很难做深入的机制分析，如转录调控，所以仅停留在定量描述和biomark层次。

 

参考：

 

应用三：单细胞蛋白质多组学

纯粹的单细胞测序分析，基因表达变成了蛋白表达。

目前还没有必须要用这类技术的理由。

https://slavovlab.net/

 

posted @ 2023-12-14 06:29  Life·Intelligence  阅读(210)  评论(0)  编辑  收藏  举报
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