Gateway Cloning | cDNA过表达载体 | pDonor | pDestination | LR reaction
2023年11月27日
Debug还是得靠自己，别人的建议仅供参考。
LR做了最少4遍，都没有靠谱的克隆出现。
一开始以为是Plasmid里RNA含量太高，稀释了DNA的含量，加了足量的Plasmid也不顶用。
只能去所用试剂的官网里找答案了：Gateway™ LR Clonase™ II Enzyme mix
I performed an LR reaction and got few or no colonies after transformation, whereas the transformation control gave colonies. Can you please offer some suggestions?
Answer
– Increase the incubation time up to 18 hours.
– Make sure to treat reactions with proteinase K before transformation.
– Check whether the correct antibiotic was used for selection.
– Check whether the att site sequences are correct.
– Check whether the correct Clonase enzyme was used and whether it was functional.
– Check whether the recommended amount of DNA was used in the reaction.
– Perform the positive control recombination with pENTR-Gus plasmid.
– If the Entry clone or Destination vector is too large (>10 kb), incubate the LR reaction overnight, linearize the Destination vector or the Entry clone or relax the Destination vector with topoisomerase I.
2023年11月21日
真的能把我气死，做了几天的实验，最后发现Plasmid搞错了，还被一通嘲笑，心态瞬间爆炸。
为了实验不失败，自己最好对所有步骤了如指掌，该用什么试剂，自己对自己负责。
基本问题：
- 什么是donor Plasmid？
- 什么是destination Plasmid？
- 什么是gateway clone？
- 什么是LR react？
Gateway技术（由Invitrogen开发）是旧系统的更现代化更有潜力的版本。Gateway利用了ccdB基因，其质粒中含有ccdB基因，当表达该基因时，细胞不能繁殖。成功克隆后，插入片段完全取代了ccdB基因，不含插入片段的菌落不能生长繁殖，因此可以高效的鉴定正确的克隆。
LR反应发生在入门载体的attL位点和目标载体的attR位点之间。该反应由LR 克隆酶混合物催化。结果，产生了两侧具有attB位点的目的DNA的表达载体。
Gateway克隆方法的优点
最核心：可以避免目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA保持其完整性，大大提高了克隆效率，常应用于大规模的DNA片段整合进同一种表达载体，因此称之为高通量基因克隆技术。
- 兼容性和灵活性：一旦您用感兴趣的DNA序列构建了入门载体，您可以通过一个重组步骤将DNA片段移动到任何表达系统中。Addgene现成的入门载体可与多种质粒一起使用。
- 快速：Gateway系统仅在1天内即可构建表达载体，而传统的限制性酶切和连接克隆则需要2天以上。而且该方法可以在同一管中进行BP和LR反应，加速了将attB-PCR产物直接克隆到目的载体中。克隆过程很简单-不需要限制性酶切，连接或凝胶纯化步骤！
- 多片段克隆：您可以使用Gateway克隆在同一个管中一次将多个DNA片段插入多个载体中。您可以在一个试管中以特定的顺序和方向将最多4个DNA片段克隆到一个Gateway载体中以产生所需的表达克隆。
- 恒定阅读框：当您将DNA片段从一个Gateway载体移动到另一个Gateway载体时，插入的DNA片段保持在框架中。
- 高效：用于Gateway克隆的阳性（抗生素）和阴性（CcdB）筛选标记可将克隆效率提高至> 99％。
- 普遍性：可以克隆所有类型的DNA片段：PCR片段，cDNA或基因组DNA，且适用于从哺乳动物到大肠杆菌的所有种类的生物。
addgene去找你要的基因cDNA是否有现成载体
用gateway cloning把你想要的cDNA克隆到特定载体里
下游常规分析
Gateway™ LR Clonase™ II Enzyme mix
Efficient genetic editing of human intestinal organoids using ribonucleoprotein-based CRISPR
https://journals.biologists.com/dmm/article/16/10/dmm050279/330768/Efficient-genetic-editing-of-human-intestinal
Gibson技术【核心是组装，应用是克隆】
Gibson组装最早由Daniel及其同事于2009年提出，该技术适于拼接多个线性DNA片段以及进行载体组装，mastermix含有三种不同类型的酶：一种外切酶，从5’端开始对DNA进行消化，产生长的黏性末端，这样便于与另外的同源末端进行配对结合；一种聚合酶，用于修补碱基的缺口；一种DNA连接酶，实现无痕拼接，形成完整的DNA分子。
从作用原理上来看，Gibson组装同样延续了传统质粒重组的碱基互补配对原则，只不过是互补序列进一步加长；该反应既需要限制性内切酶也需要限制性外切酶作用，且“酶切”(外切酶)和“连接”反应在同一个体系中完成，反应时间更短，效率更高。
Golden Gate 克隆技术
Golden Gate 克隆技术依赖于1996年首次发现的IIS型限制酶，。IIS型限制酶和传统的限制酶不同，其切割位点和识别位点不同，会在识别序列外切割出4个碱基的粘性末端，因此可以定制切割序列，如果设计成功的话，识别位点不会出现在最后的载体中，可以完成准确的无缝克隆。
克隆计划如下：在目的基因切割位点外设计IIS型限制酶（BsaI或BbsI）识别位点，酶切连接后该识别位点被消除，不会出现在最后的载体中；载体上含有与目的基因的切割位点互补的突出末端，可以指导连接。
- 1、时间短：Golden Gate克隆就实验时间而言是最简单的克隆方法，因为酶切和连接在一个30min的反应中即可完成。
- 2、效率高：destination载体和entry载体被添加在一个含有IIS型限制酶和连接酶的管中，虽然原始的destination载体和插入片段还可以自连接，但是由于仍含有IIS型限制酶识别位点，所以还会被酶切；而成功的连接产物不再含有酶切识别位点，所以连接效率接近100%。
- 3、可连接的片段多：4个碱基的特异性末端能用来连接多个片段——可以在一个反应中连接多达10个片段。不同的突出末端可以确定片段的连接顺序，连接后限制酶识别位点的消失有利于成功连接。虽然随着DNA片段数量的增加或者片段非常小或大，效率会降低，这些问题可以通过筛选更多的单克隆得以解决。
参考：
