CRISPR | CRISPR KO | CRISPRi | CRISPRa | 编辑结果检查 | 小工具

2023年07月24日

你不可能真正成功，如果你不知道什么叫做失败！【做实验尤其如此】

 

接下来的两个week，我将开始疯狂的cloning各种工具，常见的CRISPR ko/i/a都要玩一遍。

克隆的大致流程是一样的，就是要设计不同gRNA，所用的Plasmid也是不一样的，lentivirus克隆成功后就可以侵染细胞，WB看蛋白水平的变化，选择最佳的gRNA，就这么简单。

 

了解不同的CRISPR的原理：CRISPRi和CRISPRa：超越基因编辑的新工具

研究人员利用CRISPR技术开发出其他的扰动形式，比如转录沉默和表达激活。他们发现催化失活的Cas9（dCas9）在靶向原核启动子区域时会导致基因表达的抑制，这是由于转录机制的空间位阻效应。若将dCas9与阻遏结构域（如KRAB）融合，则能实现高效的转录沉默。这个过程被称为CRISPRi（CRISPR干扰）。由于DNA没有任何变化，故CRISPRi实现了可逆的knockdown，而不是knockout。

同理，dCas9融合体也可用来激活基因表达，这被称为CRISPRa（CRISPR激活）。与转录激活因子（如VP64和p65）融合的dCas9可靶向启动子和增强子区域，导致基因表达上调。为了增强“战斗力”，dCas9融合体需要招募多个激活结构域。目前人们已经开发出几种系统，包括多重融合体（VPR，即VP64、p65和Rta5的三重融合体）、使用蛋白质支架（如SunTag系统），以及使用RNA支架（如Synergistic Activation Mediator complex）。

 

CRISPR和RNAi对比：针不戳！基因表达调控看完这篇就懂了

1. 两种方法没有绝对的好坏，通常RNAi技术由于操作简便，使用广泛，但CRISPR/Cas9可使基因功能丧失更彻底，因此近些年受到广泛追捧。

2. 某些情况下不适合用RNAi，例如需要改变无法转录的DNA区域，只能用基因敲除。

3. 某些特殊情况，敲除该基因会导致细胞生长缓慢，停滞甚至死亡，这样获得基因敲除细胞株比较困难，因此就需要选择通过RNA干扰的手段实现功能减弱。

对于基因功能增强或获得来说，常用的就是过表达和基因敲入了。

CRISPR-Cas9技术的快速发展，递送载体和sgRNA设计的改进，以及CRISPR衍生技术的出现（包括CRISPRi、CRISPRa、碱基编辑、表观基因组编辑）将人们从RNAi中吸引过来。CRISPR基因敲除的效率以及高特异性和低背景，与RNAi形成了鲜明对比。RNAi的优势在于依靠内源性RNA沉默机制，因此在操作上是最简单的方法。

 

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可怕的是你不知道自己不知道什么，CRISPR看似简单，敲了就完事了吗？No，你得检查到底编辑了个啥。

Sanger测序 + TIDE可以告诉你编辑的结果，但具体结果是什么还得你自己手动查看。

 

FinchTV - 可以直接从Sanger测序结果看到编辑的位点

ensembl cDNA查看ORF - 需要点进gene最长的transcript

 

核心要点：

• 知道主要的编辑是insertion还是deletion，几个碱基
• 这样的编辑会导致stop codon在哪里出现
• 推测出主要的/最坏的编辑结果

 

抗体的结合位点是可以知道的，而且非常重要，尤其是在CRISPR KO的结果研究里。

 

比如我的抗体JARID2 - Jumonji/JARID2 Antibody

A synthetic peptide made to an N-terminal portion of the human JARID2 protein sequence (between residues 1-100). [UniProt# Q92833]