PCR Genotyping | 利用PCR来确定基因型 | Sanger sequencing | T7E1 | TIDE | NGS

 

2023年07月18日

用primer跑完PCR后，发现agarose gel有2-3个非特异性条带，于是切胶，用另一个protocol来提取gel里面的DNA。

最后一步失误地加入了PCR那一步的mixed primers（F+R），导致样本全废，只能从过滤膜里继续提取DNA了，5min提取出了3-5 mg/ul的DNA，提交了Sanger测序，结果还不错，NTC非常clean。

TIDE分析结果显示，gRNA附近有清晰的insertion和deletion，到此为止，实验成功。

后面就是功能验证，以及NGS测序，这个月我将有一大批data。

 

2023年07月14日

参考：A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing 

常见的四种CRISPR效率验证方式：

• T7 endonuclease 1 (T7E1) mismatch detection assay - 不太靠谱，只能检测NHEJ
• Tracking of Indels by Decomposition (TIDE) assay - 性价比最高的Sanger测序
• targeted next-generation sequencing (NGS) - 金标准最贵
• Indel Detection by Amplicon Analysis (IDAA) assay

 

 

 

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2023年07月05日

结果解读：

1. agarose条带，大部分是正常的，达到了送样标准；

2. Sanger结果，测序本身前50bp、后20bp很多N base，测序是不准的，所以你得primer不能太靠近gRNA，必须预留最少150-200bp；

 

结果就是要为gRNA重新设计primer，确保其有足够的距离（200bp）；

如何设计primer，参见：引物设计 | Primer design 

 

然后结果可以用一些工具来处理：

• https://ice.synthego.com/#/ - PB推荐
• https://tide.nki.nl SANGER - Paul
• http://crispresso2.pinellolab.org/submission - NGS - Paul

 

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PCR目标区域DNA扩增流程：

1. Trypsinizing Cells，取50000-100000 cells；
2. 离心，500-1000rcf for 5min，丢掉培养液，注意不要丢掉细胞沉淀cell pellet；
3. 加入试剂盒里的dilution buff和DNA release additive，室温2min，98度5分钟，spin，取上清液supernatant 1ul；
4. 加入2.5 ul primer混合液，再加入25ul PCR master mix；
5. 加入dw至50 ul；
6. 上机，选Paul - Conoly PCR vector-specific TD65 1kb；
7. 配置Agarose gel，看目标长度250-450是否有band，有就可以送样测序了；
8. 取出2ul PCR product + 13ul dilute printer (5ul F primer + 250ul dw), 送去Dropbox盒子，ddl 7PM；

所需试剂：

• Gibco™ Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red
• Thermo Scientific™ Phire Tissue Direct PCR Master Mix
• genewiz 

 

primer配方：

• 在IDT oligos管里直接溶解，Double distilled water NF，管子上标记多少，就加入x10倍的dw溶解；
• 然后配置混合液，10ul F + 10ul R + 80ul dw = 100ul，等于稀释了10倍；【可以直接用于qRT-PCR】
• 然后取2.5ul mix，准备PCR，计算如下C1xV1 = C2xV2，C1=10，C2=0.5，V2=50，所以V1=2.5；

 

Quick Agarose protocol:

1. Agarose LE 1.5g
2. TAE buffer 150 ml
3. Wait 1-2min
4. Add SYBR safe dye for gel (1:10000) 15ul
5. Plug in comb, cool down for 10 min
6. Add 5ul ladder (purple one), 5ul PCR product
7. 120-150V for 20-35min
8. Check bottom Yellow band (should reach the bottom)

 

 

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前面已经利用了PCR做了一些核心的实验：

• 目标区域扩增
• 实时定量mRNA

 

这里的目的还是目标区域扩增，不过material不再是细菌DNA，而是human cancer cell line的DNA（只需要几千细胞即可）。

 

Kits和protocol：

• 2X Phire Tissue Direct PCR Master Mix 【中等级别DNA提纯方案，仅适用于genotyping单个基因】
• Direct PCR on Hair: A New Animal-Friendly Genotyping Method
• 740951.50 NucleoSpin® Blood 【最高纯度的DNA提取方案，可直接用于WGS测序，Broad在用】

 

uM = micromole

 

 

注意：

1. Primer的保存浓度是一定的，10nmol + 100ul dw = 0.1 nM/uL，0.5 uM / 0.1 = 5 uL；
2. 不要直接放入dirty cells，最好使用Dilution & Storage Protocol，98 °C for 5 minutes；

 

然后run一下agar gel，看一下目标区域是否有条带；

然后就可以送样，做sanger sequencing，第二天就能得到结果了。