引物设计 | Primer design

 

2023年10月06日 

准备做JARID2的reporter和dTAG，需要引物来确定产物。

1. 找到stop codon
2. view - DNA - get DNA （-350，+350）
3. https://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi 
4. Targets: 100,500 （第一个参数是起始base，第二个参数是之后多长的距离，primer必须包含这段序列，结果里这段序列会被标绿）
5. Product Size Ranges：501-600
6. Validate primers：https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?hgsid=1724955790_GNFnrlG3YHzfvaJOhL7UOfiMFjaJ

 

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1.确定你的目标区域，这里我想PCR来确认我的gRNA是否工作。

所以我需要check我的gRNA在genome上的binding，这是我CRISPick设计的gRNA序列：AGTCGTAGGAGAGTAGGTAC

 

2. ucsc genome browser，BLAT，browse result，查看YourSeq。

zoom in，查看是否存在NGG的PAM序列，往左3-4个base则是CRISPR Cut的位点；

shift drag to select 500-1000 bases，有200bp的scale来确定序列长度；

View - DNA - get DNA

确保DNA序列在1000bp左右。

确定gRNA的RT序列在提取的DNA中间。

 

3. go to Primer3Plus website

paste DNA sequence

target parameter: 300,500 【第一个参数是起始base，第二个参数是之后多长的距离，primer必须包含这段序列，结果里这段序列会被标绿】

设置PCR product长度，600-700

确保RT序列在两个primers之间。

需要确认的：

1. 使用UCSC里in silico PCR工具，用primer提取PCR product，检查产物长度是否在600左右；
2. 搜索我的gRNA，确保PCR product包含了gRNA，且gRNA左右各保留了200bp左右，用于Sanger防错；

 

4. 去IDT里订购primer序列

 

参考：

• /Users/zhixinli/Dropbox (Partners HealthCare)/LI-LAB-v0/Materials/Cloning