Cancer实验系列之一 | 开篇 | Molecular cloning | 分子克隆

 

2023年08月03日

昨天正式宣告我的克隆成功，提取出来的质粒浓度最高可达15000，最低也有2000，而且已经经过Sanger测序的确认。

核心点就是：1. 磷酸化的oligos不要稀释；2. digested的Plasmid需要500ng；

其他的按部就班就行，非常简答。

 

2023年07月28日

没想到自己已经开始正式做实验两个月了！

上次做的两个KO gRNA都不错，但因为设计不当，导致蛋白水平看不到明显变化，不得不重做，也不是一无是处。

这两个月我已经掌握了如下核心技能：

  • cell line培养
  • CIRSPR KO处理
  • qRT-PCR，WB
  • Conoly formation assay、CTG 

现在我在进行全面克隆，势必要掌握所有主流的基因表达操纵技术！！！

 

记录一些成功失败的经验：

  1. 在Paul的指导下成功了，用的golden gate，磷酸化的稀释了100倍，后面一切顺利，就是表型不对；
  2. 我自己尝试了，普通的ligation，磷酸化未稀释，50ng的digested Plasmid，然后shRNA1-2有~10个左右克隆，但因为overgrowth，且不全，于是必须得重做；
  3. 磷酸化稀释100倍，50ng的digested Plasmid，什么都没有，反倒是污染的shRNA4长得和positive control一样正常；
  4. 磷酸化稀释10倍，50ng的digested Plasmid，克隆非常少，但到中午后突然冒出来了几个克隆，400ul SOC过多，300ul足矣；
  5. 磷酸化不稀释，Plasmid加500ng，等待结果，因为正常1ul raw Plasmid可以正常生长；

教训： 

  • 最好设置两个control，一个positive，即raw Plasmid；一个negative，就是digested Plasmid；
  • Cloning可以错的地方很少，主要在ligation，即磷酸化oligos的浓度，以及digested Plasmid的浓度！！！

 

2023年05月30日

上周发现自己犯了一个致命的错误，实验居然没有control！！！

操作上必须有两个control，一个空白：用来作为筛选的对照，理论上没有lentivirus的都会被puro杀死；一个NTC：这才是真正的对照，用来作为基准。

于是不得不补充LS180的对照，顺便吧HT115和HT29都做了，HT29是我们CRIPSR screening的细胞系，也是dual-report system所使用的细胞系，理论上是肯定可以检测出表型的。

细节：

  • Polybrene is a cationic polymer that improves lentiviral and adenoviral transduction efficiency in mammalian cells in vitro.

 

2023年05月25日

之前理解错了，ampicillin是可以杀细菌的。Ampicillin is a medication used to manage and treat certain bacterial infections.

而Puromycin则是用来杀细胞的。Puromycin is a naturally occurring aminonucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis by ribosome-catalyzed incorporation into the C-terminus of elongating nascent chains, blocking further extension and resulting in premature termination of translation.

但是我们的lentivirus里有puromycin N-acetyltransferase酶，可以让其失活，从而达到细胞选择的作用。

接下来需要每天观察，是否有细胞存活，从而判断是否有lentivirus入侵成功。

 

2023年05月22日

这次的细胞长得非常好，周五下午collect了一次，今天周一又collect了一次，所以这次第二批的lentivirus质量应该是非常不错的，应该不会被puro杀死。

Harvard的technician开始不配合，想给我穿小鞋，可是实验室的lab member多啊，又不是只能找你一个，你不配合不代表我不能完成我的实验。

今天上午也是手忙脚乱了两个小时：

  1. detach LS180 cells，3ml trypsin + 5ml CM（complete medium），然后做cell counting，这次的浓度是4x10^6，一共8ml，所以有32 million的细胞；
  2. seed cells，取1M的细胞（明天就是2M），按浓度计算，我们只需要0.25ml，然后加入1.75ml的CM，6 well-plate的上限就是2ml；
  3. 剩余的LS180细胞需要冷冻起来，下次备用，所以需要配冷冻液（25ml FBS 50%，-20度 + 20ml DMEM 40% pure版本 + 5ml DMSO 10% 棕瓶）；
  4. 取4ml的细胞液，500rpf 5min离心，注意平衡，然后吸走上层培养液，加入4ml冷冻液，cryovial管+标签，然后放入圆形缓冲盒，略微拧紧，-80过夜，第二天放入液氮长期保存；

 

注意（细节很多）：

  • 所有涉及到细胞的操作都应该在TC里无菌处理，所有lentivirus都要在lenti-room里操作，细菌则可以在外面直接操作；
  • LS180 detach很慢，其他的只要2min，它却要10min左右，需要不断在显微镜下观察；
  • trypsin和CM的比例应该是1:5至1:6
  • cell counting需要在板上混合10ul染剂+10ul的细胞液，然后取10ul即可计数，非常简单；
  • 对于这种大量的细胞培养，每次计数或者取样前都需要混合均匀，不然细胞沉降后就会产生大误差；
  • 以后可以长期冷冻保存属于自己的cell line了，至此所有cancer的cell line model基本掌握；

 

2023年05月17日

上次为了赶进度，直接用了Pratyusha的HEK细胞，连attachment都不等，结果导致HEK细胞不正常，大部分都是clump，因而难以产生高质量的lentivirus。

因为lentivirus侵染需要等2周，为了减少失败代价，今天必须重新开始做，从HEK细胞的培养开始。

  1. 小培养板，0.5ml的Trypsin，培养2min，detach细胞；
  2. 加入5ml的complete medium，就是DMEM + 10%FBS + antibiotic；
  3. 将4ml的HEK细胞平分到6 well plate里的4个，再加入1ml的培养液；
  4. 原来小培养板里再加入3ml的培养液，继续培养；

HEK cell culture

small plate (?ml) + 0.5 Trypsin for 2min

5ml CM DMEM + 10% FBS + antibiotic

take 1ml for 4 wells in 6 wells plate, then add 1ml for each well, finally you will have 2ml for each well

the remain 1ml HEK cells + 3ml, continue for culture 

参考：

  • FBS is the liquid portion that remains after blood is drawn from bovine fetus coagulates. It's the most widely used serum supplement for in-vitro cell culture (for eukaryotic cells). Additionally, it plays a vital role in the research of human and veterinary vaccines and has applications in stem cell research.
  • Complete Cell Culture Medium is a complete medium designed for the culture of animal and human Cells. It was tested and optimized with Cell culture in vitro.

 

2023年05月15日

提质粒算是最没有难度的实验了，周天从-80解冻了E coli，周一来了直接用。

主要是BB buffer（核心的binding）要加2ml，上次只加了2ul，而且BB buffer会快速往下漏，所以最好在注射器过滤后加入，并混合均匀。

如此最终dsDNA的浓度便就稳定在400ng/ul左右。

今天也一次性把lentivirus packaging给做了。

  1. 混合液，200ul opti-MEM + 4ul X-treme
  2. 固定两质粒，1ul PAX，1ul MD
  3. 我们定制的质粒，2000ul / 400 ng/ul = 5ul

detach HEK cell，然后加入2ml anti-anti medium，然后加入200ul左右的混合液，去lenti room培养；

24h和48h提取培养液

-80保存lentivirus

 

2023年05月11日

今天做最后一步，质粒提取，还是失败了，主要是后面设备没搞好，管子也搞错了，手忙脚乱，然后还擅自加了一个buff，导致DNA浓度只有不到10，正常应该在1000左右。

出错的步骤可能有两个：

  • 错误地顺序加了BB buffer
  • 最后用water洗脱，而不是用EB buffer

众多buffer：

  • Buffer P1 is a resuspension buffer used when purifying plasmid DNA. 
  • Buffer P2 is a lysis buffer solution produced by Qiagen. It contains 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) (w/v) to puncture holes in cellular membranes, and 200mM NaOH. It is used in conjunction with other resuspension buffers and lysis buffers to release DNA from cells, often as part of the alkaline lysis method of purifying plasmid DNA from bacterial cell culture
  • Buffer S3  is a proprietary component of QIAGEN Plasmid Plus Kits and is an plays and important role in the alkaline lysis procedure.
  • Buffer BB is a proprietary component of QIAGEN Plasmid Plus Kits and functions as a binding buffer, adjusting the correct binding conditions after alkaline lysis, when performing the QIAGEN Plasmid Plus procedure.
  • Buffer ETR is a proprietary component of QIAGEN Plasmid Plus Kits and functions as an endotoxin removal buffer.
  • Buffer PE is a wash buffer for use in DNA cleanup procedures.
  • Buffer EB is the elution buffer used in the QIAquick PCR, Gel Extraction, Nucleotide Removal Kits, and MinElute Kits for DNA cleanup, and the QIAprep Miniprep Kits for small-scale plasmid purification.

 

2023年05月10日 

昨天做了transformation，今天终于长出了clone，果然要一步一步的扣protocol，确保万无一失。

经验：

  • 仔细思考可能出错的环节，确保该步骤不会出错；
  • 最大的失误可能就是微量底物的添加（1ul），一定要确保加入了（管壁），如果不确定，则宁可再加一次，也不要就此忽略；
  • 其实大部分的步骤都很灵活，不必完全按照protocol来，比如磁珠可以不用移除可直接使用；

今天要做的就是提取质粒（Colony PCR），sanger测序，如果顺利明天就可以package lentivirus了。

  1. 75ul LB+Cb培养液
  2. 用tips挑取3个colonies，培养1小时
  3. colony PCR，只需要用tips dip一下就行，1ul都太多
  4. run agar gel，看370 bp附近是否有条带
  5. sanger sequencing，查看gRNA序列是否真的存在于PCR产物之中

基础知识：

  • 熟悉实验室的DNA ladder 5kb：Thermo Scientific™ GeneRuler Express DNA Ladder, ready-to-use
  • Colony PCR is a method for rapidly screening colonies of yeast or bacteria that have grown up on selective media following a transformation step, to verify that the desired genetic construct is present, or to amplify a portion of the construct.
  • LB Broth (1X) is a ready-to-use liquid growth media used for bacterial culture. Our filter-sterilized LB Broth can be used for nearly all applications that require a liquid bacterial culturing step, such as protein expression, cloning, and expansion. 
  • Cb dish: Carbenicillin is also more stable at lower pH than ampicillin. 【ampicillin的替代品】
  • Thermo Scientific PCR Master Mix is a 2X concentrated solution of Taq DNA Polymerase, dNTPs, and all of the components required for PCR, except DNA template and primers. 
  • Lysogeny broth (LB) is a nutritionally rich medium primarily used for the growth of bacteria.

 

2023年05月08日

周六过来收获扩增的质粒细菌，发现几乎没有Clone，没有抗生素基因的细菌都被杀死了。（AmpR for bacteria，PuroR for cell）

于是今天照着protocol，仔仔细细重新再做一遍。

 

2023年05月05日

recap：昨天处理了oligos（磷酸修饰、double strand，PCR仪器里操作），然后用golden gate试剂在PCR仪器里拼接（10小时），理论上就能得到带有插入片段（gRNA）的Plasmid（已经包含tracerRNA和CAS9基因序列）。

今天要做的是transformation，也就是将Plasmid转入到基因改造的Ecoli里（抑制了recombination，防止序列突变）。

因为经过了PCR，有很多杂质，所以首先需要提纯DNA，这里用的是AMPure XP Beads，磁珠会结合DNA，丢弃废液，然后80%乙醇覆盖洗两次，洗去盐分，然后用DW纯水就能分离出Plasmid DNA，5/50的比例混合30min即可。

有时也会用Gel and PCR Clean‑up来分离纯化DNA。

然后42度水浴45秒，至于冰上，加入400ul soc growth medium；

接着去温室摇床培养1小时；

最后取450ul在细菌培养皿上过夜培养16小时；

注意：

  • Ecoli要用特定的抑制recombination的，否则结果会失真；
  • -80拿出来的Ecoli只能在冰上解冻，切不可直接解冻。
  • DNA一定需要纯化再放入Ecoli；
  • 混合后不要vortex，Ecoli非常脆弱；

参考：

 

2023年05月04日

拿到oligos之后

  1. phosphorylation modification of oligos 3' to fit plasmid DNA + combine TOP and BOTTOM oligos to double-strand DNA【一步完成】
  2. dilute 1000 times, get 1mL for Golden Gate Assembly (NEBridge® Golden Gate Assembly Kit (BsmBI-v2))
  3. transformation DNA to bacteria 

参考：

 

2023年05月03日

设计gRNA + 订购oligos

这里我们用broad开发的CRISPick网页工具，Human GRCh38(Ensembl v.109) - RISPRko - Chen (2013) tracrRNA （根据你的vector来定），然后会得到gRNA序列。

然后加入限制性内切酶的adapter接头，每个gRNA都有TOP和BOTTOM两个序列，BOTTOM需要做一个reverse complement（https://www.genscript.com/sms2/rev_comp.html），如果超过10个则可以考虑写个R脚本。

最后去IDT下订单，选择SameDay™ DNA Oligos，一个oligos大概4刀，非常便宜。

gRNA左边加上caccg，反向互补加上aaac，以及一个c，匹配TOP oligos。【非常简单直接】

 

我们用的是pCC01这个vector，可以在gRNA原件附近找到酶切位点

  • - google idt crispr, three elements: Cas9 + tracRNA + gRNA [Cas9 and tracRNA are in fixed in plasmid, only need to consider gRNA design, PAM is in genome]
  • - pCC01: CRISPR KO (one-vector-system)
  • - pCC09: CRISPRi dCas9-KRAB (one-vector-system)
  • - pBA904: encodes the gRNA to be used with CRISPRi dCas9-KRAB-Zim3 (two-vector-system)
  • - pJB109: encodes the dCas9-KRAB-Zim3 (two-vector system)
  • - pPD01.gb: replace puro by EGFP in pCC01

 

vector/construct的基本结构：

  • Ori，origin of replication，复制起点
  • survival gene，antibiotic resistance gene
  • restriction sites，multiple cloing sites（多个酶切位点），insert gene
  • promoter，控制insert gene的表达，与Plasmid复制是相互独立的，RNA polymerase结合表达
  • selectable marker

What is a Plasmid? - Plasmids 101

 

需要去DepMap检查depend的cell line

https://depmap.org/portal/interactive/

  • X Axis - CRISPR
  • Y Axis - Expression
  • Filter by Colorectal Adenocarcinoma
  • Color by Tumor type

Negative the Gene Effect即代表dependent，即表示该细胞系的生长依赖该基因。

Methods：Genes differentially expressed between tumor and normal tissue from the Cancer Genome Atlas (TCGA) and genes related to cell viability by CRISPR-cas9 screening from Depmap (Cancer Dependency Map) were overlapped.
方法：将癌症基因组图谱 (TCGA) 中肿瘤和正常组织之间差异表达的基因与 Depmap (Cancer Dependency Map) 中通过 CRISPR-cas9 筛选的与细胞活力相关的基因重叠。

Outcome from DEMETER2 or Chronos.

A lower score means that a gene is more likely to be dependent in a given cell line. A score of 0 is equivalent to a gene that is not essential whereas a score of -1 corresponds to the median of all common essential genes.

 

 

必须要开这个系列了，而且要对实操有一定的理解，没一篇我都会咨询实验成功过的人士，以确保未来我能带领小弟们做出来【得有Paper最为示范，不然小弟们没信心】，成本核算也是非常重要的。

 

未来要开的系列：

Cancer模型系列：

  • Cell line （DepMap, adherent or ultra-low-attachment culture）
  • Mouse （JAX）
  • xenograft（primary tumor growth, cell line, patient tumor）
  • Organoid
  • Patient sample（endoscopic resection samples）

基础实验系列：

  • WB
  • RT-PCR
  • co-IP（接RIME或者WB、mass spectrum）
  • Histopathology (H&E, IHC/ICC/IF, Ki67, AB-PAS)
  • Proliferation （CellTiterGlo）

基因表达调控系列：

  • 基因表达调控 - RNAi（shRNA siRNA）
  • 基因表达调控 - CRISPR/Cas9
  • 基因表达调控 - 过表达 CDS
  • 基因表达调控 - 过表达 doxycycline inducible overexpression
  • 基因表达调控+标记 - Cre/LoxP

NGS系列：

  • RNA-seq
  • ChIP-seq
  • ATAC-seq
  • Cut&Run
  • Chem-seq
  • scRNA-seq
  • scRNA-seq/scATAC-seq
  • Perturb-seq
  • Spatial transcriptome

高阶实验系列：

  • soft agar colony formation assay （potential of malignant cells）
  • ClonMapper （lineage tracing）

 

2023年03月15日

第一课：Passaging Cells: Cell Culture Basics

目的：从培养皿里获取细胞，放入六孔板中准备处理，剩余细胞在培养皿里继续培养重复利用。

cell line: HEK

reagent: trypen-EDTA for detach, DMEMC for culture

cell counting, 10ul dye + 10ul cells = 1.6 x 106 cell / ml

 

第二课：make plasmid：How to Design Plasmids: Benchling Tutorial

Designing gRNA Oligos to Clone into Cas9 Expression Plasmids for KO Experiments

Constructing Plasmids for Cas9/gRNA Expression and Knock Out Experiments

EcoRI + AgeI 限制性内切酶切割

pUC19 最为广泛应用的质粒

Lentiviral Packaging Plasmid Mix: psPAX2 + pMD2

How to use Snapgene (Basic features explained)

 

细菌DNA过滤系统：沉淀 + 三个wash试剂

QIAGEN Plasmid Plus Midi kit

DNA Isolation from bacterial culture

DNA浓度测定仪器

 

DNA电泳 Agarose gel electrophoresis

Agarose Gel Electrophoresis

配胶，EDTA + H2O，煮沸，制胶

ladder + 样本，荧光剂

 

第三课：make lentivirus: The Basics of Lentivirus Production/Packaging: Protocol, Tips, and more!

了解第二代lentivirus，三质粒系统：The Basics of the Recombinant Lentivirus System

使用制备好的lentivirus转染细胞：Lentivirus Transduction Protocol: Infecting your target cells

 

第四课：WB，western blot

试剂盒：Pierce™ Rapid Gold BCA Protein Assay Kit

首先准备组织细胞，处理CDX2 mouse，然后解剖，tumor取样；

然后准备蛋白液，加入特定缓冲液，捣碎成细胞，裂解成蛋白液；

接着蛋白总量计算，加入Rapid kit试剂，在FLUOstar omega上快速定量，ladder两个重复，样品两个重复，可以在Excel里构建linear model；

然后准备等量的蛋白液准备跑胶，DTT、RIPA、laemmli，每个样本准备2-4个Gel的量；

最后就是跑胶、转移到膜上，抗体显色； 

 

第五课：IF，鉴定特定蛋白在nuclear和cytoplasm的表达情况 【NC文章里做了HDAC的分析】 

Immunofluorescent Staining Protocol - YT

 

第六课：sanger sequencing，高准确度的短序列DNA测序，结合PCR

Sanger sequencing - YT

原理很简单，没有OH，PCR就会终止，ATCG带原料带不同荧光，即可跑胶，根据不同位置的荧光情况来读取碱基类型，这就是最终的带颜色的曲线图。

 

第n课：dTAG

advantage：gradient recovery system，reversiable。

结合cut&run即可产出非常丰富的数据。

The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation - NCB - 2018

 

 

 

免疫组织化学Immunohistochemistry (IHC)，免疫细胞化学Immunocytochemistry (ICC)，免疫荧光 Immunofluorescence (IF)区别

 

目的：

  • 只要是生信和实验，通过in silico或者screening找到了hit，那肯定是要验证的，过表达实验很难，那就down吧，RNAi是首选，所以要把siRNA或者shRNA放进质粒载体，去小鼠或者其Organoid里测试。

 

Molecular cloning refers to the isolation of a DNA sequence from any species (often a gene), and its insertion into a vector for propagation, without alteration of the original DNA sequence.

 

质粒选择：

 

Using RIME to Analyze Protein-Protein Interactions on Chromatin

Co-immunoprecipitation troubleshooting, tips and tricks 

 

参考：

 

posted @ 2023-02-24 04:00  Life·Intelligence  阅读(187)  评论(0)  编辑  收藏  举报
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