Pipeline - 玩转10x单细胞 | scRNA-seq | scATAC-seq | Spatial transcriptome | CRISPR | Perturb-seq

 

10x是最成功的单细胞公司，目前最成功的商业平台，已经有很多成熟的单细胞产品线，不管是新手还是进阶的高手都在玩他们平台产生的数据。

这里试图对10x的核心技术和数据来做一个剖析，试图理解其核心原理，加速数据分析进程，辅助科研发现。

 

我目前玩过的10x数据：

  • scRNA-seq (antibody hashtag)
  • visum - Spatial transcriptome
  • scATAC-seq
  • Perturb-seq (CRISPR library)

可玩性非常高，特别是结合具体的临床医学问题。

 

分析所使用的工具：

  • cellranger 【分析常规scRNA-seq，antibody hashtag，Perturb-seq】 
  • spaceranger 【visum空间转录组数据】
  • cellranger-atac 【独立分析ATAC数据】
  • cellranger ARC 【联合分析RNA和ATAC，multi-omics】

 

参考：

单独ATAC

联合分析RNA+ATAC

多样本合并：

 

目录

  • QC
  • 分析流程（基本+高级）
  • 建库原理
  • 单细胞展望
  • 疑难杂症

 

分析流程

fastq

【一般测序公司会直接提供，最开始的时候还得自己bcl2fastq】

但fastq的格式每个测序平台会有差异

最常见的格式【所有index都直接放进了R1和R2里，paired end 150bp】：

-rw-r--r--  1 zxli  staff   9.0G Mar 25  2021 UE-D60-BO-2-1_S21_L003_R1_001.fastq.gz
-rw-r--r--  1 zxli  staff   5.3G Mar 25  2021 UE-D60-BO-2-3_S23_L003_R2_001.fastq.gz
-rw-r--r--  1 zxli  staff   8.2G Mar 25  2021 UE-D60-BO-2-1_S21_L003_R2_001.fastq.gz
-rw-r--r--  1 zxli  staff   6.2G Mar 25  2021 UE-D60-BO-2-2_S22_L003_R2_001.fastq.gz
-rw-r--r--  1 zxli  staff   5.6G Mar 25  2021 UE-D60-BO-2-4_S24_L003_R2_001.fastq.gz
-rw-r--r--  1 zxli  staff   6.2G Mar 25  2021 UE-D60-BO-2-4_S24_L003_R1_001.fastq.gz
-rw-r--r--  1 zxli  staff   5.8G Mar 25  2021 UE-D60-BO-2-3_S23_L003_R1_001.fastq.gz
-rw-r--r--  1 zxli  staff   6.7G Mar 25  2021 UE-D60-BO-2-2_S22_L003_R1_001.fastq.gz

　　

这时的分析脚本的参数就是：

sampleName=UE-D60-BO-2
--sample=${sampleName}-1,${sampleName}-2,${sampleName}-3,${sampleName}-4

　　

另一种就是index单独存放，可以存成一个fastq，也可以是单独的两个fastq

-rw-r--r-- 1 lizhixin engan 235M Aug 22 12:35 HT29_P1_CRISPR_CKDL220019395-1A_H7MJYDSX5_S1_L003_I1_001.fastq.gz
-rw-r--r-- 1 lizhixin engan 259M Aug 22 12:35 HT29_P1_CRISPR_CKDL220019395-1A_H7MJYDSX5_S1_L003_I2_001.fastq.gz
-rw-r--r-- 1 lizhixin engan 1.8G Aug 22 12:38 HT29_P1_CRISPR_CKDL220019395-1A_H7MJYDSX5_S1_L003_R1_001.fastq.gz
-rw-r--r-- 1 lizhixin engan 1.7G Aug 22 12:41 HT29_P1_CRISPR_CKDL220019395-1A_H7MJYDSX5_S1_L003_R2_001.fastq.gz

　　

这时的分析脚本的参数就是：

--sample=HT29_P1_GEX_CKDL220019394-1A_H7MN2DSX5

　　

cellranger在你填错sample name的时候会提醒你！

 

cellranger arc资源耗用

某个样品一共50G的fastq，CPU基本吃满10核，内存大概占用40G，跑了7个半小时。

某个样品一共120G的fastq，已经跑了14个小时了。

 

matrix

10x的诸多测序都是使用三个文件的matrix来存储，放在filtered_feature_bc_matrix里

-rw-r--r-- 1 lizhixin engan 137M Aug 23 00:21 matrix.mtx.gz
-rw-r--r-- 1 lizhixin engan 326K Aug 23 00:21 features.tsv.gz
-rw-r--r-- 1 lizhixin engan  56K Aug 23 00:21 barcodes.tsv.gz

最新的是For sparse matrices, the matrix is stored in the Market Exchange Format (MEX)，防止冗余，文件就只有几百M（~1w细胞 x 3w基因）。

第一列就是行坐标，第二列就是列坐标，省去了字符串，方便压缩。

唯一的字符串，基因名和细胞名则单独存放成文件。

 

QC

分为：

  • 上游QC - cellranger的报告足矣
  • 下游QC - 基于count矩阵的QC，也是必不可少

 

参考：

 

下游分析downstream

下游的分析标准流程我只用Seurat，API做得好，功能丰富，速度快，完全没有自己开发的必要，工欲善其事必先利其器。

一些个性化的分析就可以用其他工具，Seurat的数据导出也是非常方便，甚至自己可以基于其结构开开发自己的工具。

很多事情必须做严谨，不能糊弄过去，建议做一个tutorial，每次照着分析，评估过关即可。

QC

  • doublets 

 Annotation

 

参考：

 

建库原理

最好还是搞懂吧，一切皆是接口，搞懂了自己也可以随便玩。

  • scRNA-seq (antibody hashtag)
  • visum - Spatial transcriptome
  • scATAC-seq
  • Perturb-seq (CRISPR library)

 

 

单细胞展望

towards the end, the ultimate architecture of life!

 

疑难杂症

1.找不到chemistry

Log message:
An extremely low rate of correct barcodes was observed for all the candidate chemistry choices for the input: Sample Pool111-2_23 in "/home/lizhixin/project/scRNA-seq/rawData/10x/ApcKO/Day_04_RNA". Please check your input data.
- 1.3% for chemistry SC3Pv3
- 1.3% for chemistry SC3Pv3HT
- 0.1% for chemistry SC3Pv3LT
- 0.1% for chemistry SC5P-R2
- 0.1% for chemistry SC3Pv2

[error] Unable to auto-detect chemistry. Sample def 0/Pool111-2_23: Fraction of barcodes on whitelist was at best 1.3
1%, while we expected at least 10.00% for one of the chemistries.

确定了是试剂盒的问题，用的不是正常的10x试剂盒。

参考：

 

 

待续~

 

posted @ 2022-08-23 18:23  Life·Intelligence  阅读(1416)  评论(0)  编辑  收藏  举报
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