gRNA design | CRISPR Screen | single-cell | Perturb-seq | 数据分析

 

2023年06月08日

gRNA设计是CRISPR基因编辑的核心，KO比较简单，可选择的gRNA很多，而对于需要指定locus的编辑，如CRISPRa, CRISPRi, base editing等，可选择的就很少。

可以选择现成的工具：https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public

CRISPR衍生品很多，甚至可以编辑表观标记，EP300 dcas9

Epigenome editing by a CRISPR/Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers - NBT - 2015

 

参考：

 

 

2023年05月03日

参考：

分析

先从数据分析开始：

安装

conda create -c bioconda -n mageckenv mageck # 0.5.9.5
source activate mageckenv
# conda update mageck
# source deactivate

 

barcode序列下载：https://www.addgene.org/pooled-library/liu-crispr-knockout-h3/　

　

mageck count -l yusa_library.csv -n escneg --sample-label "plasmid,ESC1" --fastq ERR376998.fastq  ERR376999.fastq
mageck test -k escneg.count.txt -t ESC1 -c plasmid -n esccp　

分析非常简单，两行代码就搞定了。

 

2023年06月14日

就我们实验室的数据而言，我们有三个fastq文件，每个3-4G，等于是三个重复，可以merge或分开处理获得显著性。

每个fastq可以被拆成9个样本，对应了9个细胞群体，等于9合一，加入了staggered p5 primers。

Illumina index is only on the p7 side
Novogene will give FASTQ based on the p7 barcode
Demultiplex based on the staggered p5 primers

 

 

 

原理

Nature Genetics：CRISPR Screen结合生化筛选获得功能基因

也很简单，就是gRNA侵染，然后按marker筛选Clone，然后做差异对比。比如抑制differentiation的gene KO应该富集在KRT20高表达的细胞里。

 

 

 

2023年02月27日

第一代perturb-seq：CROP-seq

  • https://www.bocklab.org/resources/crop-seq
  • Arrayed screens - 最开始的形式，就是类似smart-seq，低通量高质量高劳力
  • combine pooled CRISPR screening - 10x模式
  • Pooled CRISPR screening with single-cell transcriptome readout - nature methods - 2017
  • 一句话总结：用lentivirous将sgRNA整合进genome，然后转录成带有polyA的mRNA，然后被固定在bead上的polyT捕获。gRNA依赖polyA。
  • 由于盒大小的限制，CROP-seq被认为与多种sgRNA的递送不兼容。
  • 第一批应用：Perturb-seq: Dissecting molecular circuits with scalable single cell RNA profiling of pooled genetic screens - 2017 - Cell

第一代其他：

  • Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq - Science - 2016 【CRISP-seq】
  • Multiplexed Engineering and Analysis of Combinatorial Enhancer Activity in Single Cells - Molecular cell - 2017 【Mosaic-seq】

第二代perturb-seq：direct guide RNA capture

 

第三代ClonMapper【我认为的第三代，可以将静态的RNA-seq变为动态的。】

 

 

2022年09月10日

最近才开始摸这部分数据，但也算不错啦，直接上手single-cell的perturb-seq。

 

Mixscape流程简单易用，已经成功跑完了，结果也很make sense

参考：project/Data_center/analysis/Perturb_seq_Sethi/cellranger

 

接下来玩一下scMAGeCK

安装

conda install -c bioconda mageck pysam

　　

大部分时间都在搞格式对接，明明Seurat已经够好用了，且已经整合为seurat格式了，却还是搞出这种畸形的接口，到底是人性使然，不想依附于人，受制于人。

 

 

 

问题：

  • 基本原理
  • 实际应用

 

GWAS是在大自然的数据中去筛选疾病associated genes

CRISPR Screening则是在人为的库里筛选疾病associated genes

 

分析：

  • GWAS的最大用途就是大数据，样本量上去了就很好搞，但现在几乎很难搞到大数据了，已经被瓜分得差不多了，就算你有钱也搞不到，样本受医生的控制，适合关系党；
  • CRISPR Screening不受限制，有钱就能筛，有一点的实验设计门槛，适合技术党；

 

核心的原理就是通过对比，找到表型关联基因，非常直接。

 

 

研究范文：

  • CRISPR Screens Identify Essential Cell Growth Mediators in BRAF Inhibitor-resistant Melanoma - 2020
  • 2021. In vivo CRISPR screens identify the E3 ligase Cop1 as a modulator of macrophage infiltration and cancer immunotherapy target. Cell

 

 

参考：

  • 精准大海捞针--CRISPR screening专题

 

posted @ 2022-02-21 20:48  Life·Intelligence  阅读(859)  评论(0)  编辑  收藏  举报
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