gRNA design | CRISPR Screen | single-cell | Perturb-seq | 数据分析

 

2023年06月08日

gRNA设计是CRISPR基因编辑的核心,KO比较简单,可选择的gRNA很多,而对于需要指定locus的编辑,如CRISPRa, CRISPRi, base editing等,可选择的就很少。

可以选择现成的工具:https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public

CRISPR衍生品很多,甚至可以编辑表观标记,EP300 dcas9

Epigenome editing by a CRISPR/Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers - NBT - 2015

 

参考:

 


 

2023年05月03日

参考:

分析

先从数据分析开始:

安装

conda create -c bioconda -n mageckenv mageck # 0.5.9.5
source activate mageckenv
# conda update mageck
# source deactivate

 

barcode序列下载:https://www.addgene.org/pooled-library/liu-crispr-knockout-h3/ 

 

mageck count -l yusa_library.csv -n escneg --sample-label "plasmid,ESC1" --fastq ERR376998.fastq  ERR376999.fastq
mageck test -k escneg.count.txt -t ESC1 -c plasmid -n esccp 

分析非常简单,两行代码就搞定了。

 

2023年06月14日

就我们实验室的数据而言,我们有三个fastq文件,每个3-4G,等于是三个重复,可以merge或分开处理获得显著性。

每个fastq可以被拆成9个样本,对应了9个细胞群体,等于9合一,加入了staggered p5 primers。

Illumina index is only on the p7 side
Novogene will give FASTQ based on the p7 barcode
Demultiplex based on the staggered p5 primers

 

 


 

原理

Nature Genetics:CRISPR Screen结合生化筛选获得功能基因

也很简单,就是gRNA侵染,然后按marker筛选Clone,然后做差异对比。比如抑制differentiation的gene KO应该富集在KRT20高表达的细胞里。

 

 


 

2023年02月27日

第一代perturb-seq:CROP-seq

  • https://www.bocklab.org/resources/crop-seq
  • Arrayed screens - 最开始的形式,就是类似smart-seq,低通量高质量高劳力
  • combine pooled CRISPR screening - 10x模式
  • Pooled CRISPR screening with single-cell transcriptome readout - nature methods - 2017
  • 一句话总结:用lentivirous将sgRNA整合进genome,然后转录成带有polyA的mRNA,然后被固定在bead上的polyT捕获。gRNA依赖polyA。
  • 由于盒大小的限制,CROP-seq被认为与多种sgRNA的递送不兼容。
  • 第一批应用:Perturb-seq: Dissecting molecular circuits with scalable single cell RNA profiling of pooled genetic screens - 2017 - Cell

第一代其他:

  • Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq - Science - 2016 【CRISP-seq】
  • Multiplexed Engineering and Analysis of Combinatorial Enhancer Activity in Single Cells - Molecular cell - 2017 【Mosaic-seq】

第二代perturb-seq:direct guide RNA capture

 

第三代ClonMapper【我认为的第三代,可以将静态的RNA-seq变为动态的。】

 


 

2022年09月10日

最近才开始摸这部分数据,但也算不错啦,直接上手single-cell的perturb-seq。

 

Mixscape流程简单易用,已经成功跑完了,结果也很make sense

参考:project/Data_center/analysis/Perturb_seq_Sethi/cellranger

 

接下来玩一下scMAGeCK

安装

conda install -c bioconda mageck pysam

  

大部分时间都在搞格式对接,明明Seurat已经够好用了,且已经整合为seurat格式了,却还是搞出这种畸形的接口,到底是人性使然,不想依附于人,受制于人。

 

 


 

问题:

  • 基本原理
  • 实际应用

 

GWAS是在大自然的数据中去筛选疾病associated genes

CRISPR Screening则是在人为的库里筛选疾病associated genes

 

分析:

  • GWAS的最大用途就是大数据,样本量上去了就很好搞,但现在几乎很难搞到大数据了,已经被瓜分得差不多了,就算你有钱也搞不到,样本受医生的控制,适合关系党;
  • CRISPR Screening不受限制,有钱就能筛,有一点的实验设计门槛,适合技术党;

 

核心的原理就是通过对比,找到表型关联基因,非常直接。

 

 

研究范文:

  • CRISPR Screens Identify Essential Cell Growth Mediators in BRAF Inhibitor-resistant Melanoma - 2020
  • 2021. In vivo CRISPR screens identify the E3 ligase Cop1 as a modulator of macrophage infiltration and cancer immunotherapy target. Cell

 

 

参考:

  • 精准大海捞针--CRISPR screening专题

 

posted @ 2022-02-21 20:48  Life·Intelligence  阅读(876)  评论(0编辑  收藏  举报
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