选择模型 | 如何构建一个疾病的动物模型？ | animal model of disease

 

2023年12月14日

实验动物常见的给药方式有：注射给药，灌胃给药，口服，鼻滴给药等多种。一般需要根据实验目的、动物种类及药物剂型、剂量等，选择合适的给药方式。

小鼠常见的给药方式：

  • 皮下注射（Subcutaneous Injections，SC）
  • 皮内注射（Intradermal Injections，ID ）
  • 肌肉注射（intramuscular injection，IM）
  • 尾静脉注射（Intravenous Injections，IV）
  • 腹腔注射（Intraperitoneal Injections，IP）

重点强调：Intraperitoneal (IP) injection 腹腔注射

参考：

 

6类肿瘤异质性研究模型

in vitro和ex vivo区别

The main difference between in vitro and ex vivo assays is that the former is simply a cell system established in a cell culture laboratory.

In contrast, the latter is a tissue not created artificially but directly taken from a living organism.

 

2023年11月22日

氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）／葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate，DSS）小鼠模型是一种在致癌剂AOM和致炎剂DSS协同作用基础上，由炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）逐步发展为结直肠癌的炎症相关性癌症的研究模型。AOM／DSS模型能很好地模拟慢性肠道炎症诱发癌症的生理病理过程，近年来被广泛用于炎症相关性癌症形成机制的研究。简要综述AOM／DSS模型与炎症相关性癌症癌变机理的研究进展。 

DSS in combination with carcinogenic compounds, primarily AOM, has been proven useful for the research of colitis-induced cancer

Cooper et al[53] reported an increased CRC incidence of 40% in APCMin mice after two cycles of 4% DSS treatment compared to untreated control animals and identified the loss of heterozygosity (LOH) of Apc as underlying cause.

Loss of heterozygosity (LOH) is a common genetic event in cancer development, and is known to be involved in the somatic loss of wild-type alleles in many inherited cancer syndromes. The wider involvement of LOH in cancer is assumed to relate to unmasking a somatically mutated tumour suppressor gene through loss of the wild type allele.

当来自亲本的基因组拷贝在这些多态性区域（即SNP）上有不同的碱基，则该区域具有杂合性。体细胞内的染色体大多成对，使得SNP位置有可能出现杂合现象。但是，某一亲本某区域的的拷贝有时可能丢失，以致于某一SNP位置只有一份拷贝而无法具有杂合性，此之谓“杂合性缺失”。

癌症中经常发现有杂合性缺失，在缺失区域常常发现肿瘤抑制基因亦缺失：但是一份肿瘤抑制基因的缺失往往并不会引起癌症，因为另一份拷贝中的染色体对往往仍然存有这一基因，因而人们仍然可以在一份带有肿瘤抑制基因的拷贝丢失后仍然保持健康；然而，另一染色体对上的基因却可能因为点突变而失去作用，使得肿瘤抑制基因失效。需要说明的是，杂合性缺失并不一定代表两对基因纯合（即两对基因一模一样），这两对基因可以不同。

 

2023年06月08日 

解读一下这个mouse model

第一行：Ptf1a就是一个marker，类似Lgr5，只在epithelial cell里表达，后面跟了一个Cre，即这类细胞里有Cre蛋白，类似Cas；

第二行：默认是被stop终止的，但有Cre则会切除，mutant Kras就会表达，这也被限制在Kras表达的细胞里；

第三行：CAG是合成启动子，确保高表达，rtTA3则会表达一个dox响应的蛋白，可以与TRE结合；IRES则是一个连接序列；

第四行：由dox诱导控制的shRNA编辑；

此系统有两种荧光标记，一个是mKate2，标记了rtTA3蛋白表达的细胞，注意有蛋白没dox依旧不起作用；另一个是GFP，标记了rtTA3+dox激活的细胞，标记了shRNA工作的细胞。

看下此系统如何工作：

  • 在特定的表皮细胞里Cre表达，如果有Kras表达，则会表达突变蛋白；同时会表达rtTA3蛋白，被mKate2标记；
  • 如果有dox，GFP就表达，同时shil33会被表达出来，抑制表皮细胞里Il33的表达；

 

基本常识：

  • The CAG promoter is a strong synthetic promoter frequently used to drive high levels of gene expression in mammalian expression vectors.
  • A derivative of tetracycline, doxycycline (dox), is a preferred effector for tetracycline transregulation. Dox binds with high affinity to tTA and rtTA; thus, dox can be used in both tetracycline on and off systems.
  • IRES sequences are used to express two proteins from a single promoter in an expression construct or a transgenic construct.

 

参考：

 

2022年12月18日

把我这里需要用的CRC disease models研究清楚。

第一个：Lgr5eGFP-IRES-CreERT2;ApcloxP-exon14-loxP(Lgr5Cre;Apcf/f) 

第一部分解释Lgr5eGFP-IRES-CreERT2：这就是个transgenic mouse，首先是杂合体，因为纯合无法生存，其次就是带了融合蛋白，任何表达Lgr5的都可以被GFP检测到，最后就是CRE可以被condition诱导（tamoxifen）。Cre-Lox Conditional KO，f/f就是flox/flox的意思。

第二部分也是一个transgenic mouse，就是exon14被flox了。

有点乱，理清楚逻辑，老鼠是个体，看genotype，杂交之后也看genotype，只有在tamoxifen诱导下，Cre/LoxP系统才开始工作，这也正是我们想要的，肠道Lrg5的表皮细胞。

 

第二个：R26LSL-tdTomato (R26tdT or tdTLSL)，有点绕

工作原理，本来就有STOP cassette阻止tdTomato表达，如果与有CRE表达的杂交，就会切除STOP cassette，从而有荧光标记。可以用此来标记CRE系统起作用的细胞，比如APC KO的细胞。问题，之前Lgr5已经有GFP了，这里为什么还要tdT？

逻辑不一样，GFP标记的是Lgr5的ISC的后代，只与Lgr5的表达有关；而tdT只与Cre/LoxP系统的有效性有关，而此系统只发生在Lgr5表达，且tamoxifen诱导成功，有Cre活性的细胞，这些细胞就是Apc KO成功的细胞。【以后建立自己的实验室一定要有QA记录，这样的实验室才能不断进步。这跟审稿是一样的，平时积累好关键问题，最后找到人了也方便定点解答，一定要这样激励自己的团队。】

 

第三个：Lgr5Cre;Apcf/+;R26tdT【这里的f/+就是有一个allel是WT，为了严谨，这里的control也是注射了tamoxifen的，区别就是有一份正常的Apc】

First, we always use the “+” symbol to indicate a wildtype or unmodified allele, regardless of the kind of strain that is being described. For spontaneously or targeted mutant mice, this notation makes perfect sense: “+” indicates the wildtype allele, and “-” the mutant allele. Thus, we designate our mouse genotypes “-/-” for homozygous mutants, “+/-” for heterozygotes, and “+/+” for wildtypes. Pretty straightforward, so far, I think.

Designating genotypes: What does '+' really mean?  

 

 

2022年12月04日

依旧是生物医学研究工作者吃饭的家伙。你真的不需要学很多东西，只需要掌握一些核心的技能就可以生存了。

一个核心的有价值的生物医学问题：比如CRC起始的特征，是否能找到潜在的调控因子和靶点；

一个研究的本体模型：小鼠模型+类器官模型足矣

一个核心的高通量测序技术：基本的单细胞技术要跟

围绕着regulator，组合一些其他的对象将一些故事即可.

 

转基因小鼠transgenic mice - 特指转入外源基因的小鼠（如特定荧光蛋白标记）

基因敲除老鼠模型knockout mice - YT

Cre-LoxP系统conditionally knock out gene【有点像gRNA + CRISPR系统】

 

CRISPR gRNA plasmic

Cell line culture

Western blot

 

抗体技术

  • co-IP
  • purify target cells by cell surface protein
  • antibody + fluorescent protein

 

参考：Innate Immunity - 深入讲解了很多核心技术

https://www.youtube.com/@annelisesnyder4364 

 

 

主流的研究模型（按高大上和难易程度排名）： 

  • 斑马鱼 Zebrafish
  • 细胞系 cell line
  • 小鼠模型 mouse in vivo model
  • 干细胞（病人来源）模型 (patient) iPSC-based model
  • 类器官 organoid model
  • 病人组织 primary cells

 

选择模型

  • 模型是研究的材料来源，也是测序的本体。这里有个最基础的三位一体【疾病 + 组织细胞 + stage/time】，还有其他维度，比如gender，可以根据研究的问题细分。
  • 病人组织：最有用的模型是人本身，因为最终目的是要研究针对人的预防和治疗手段。但因为道德约束，我们只能在死去的自愿捐赠的病人身上取样，人的差异很大，样本小很难做研究。取样可行性、难度、细胞数量、保存限制，都在限制着研究。
  • 类器官：如果能完全模拟人，那就没有道德约束，什么研究都可以做了，这就是iPSC-derived organoid的初衷，但目前这个基本是玄学，类器官很难评估，烧了钱还不可靠。
  • 2D iPSC-derive cells：定向分化而来的二维目标组织，优点是可以完全模拟人的遗传多样性，容易取样，目标组织容易富集，缺点就是过于单一，大限约束。
  • 小鼠模型：最理想的模型是小鼠，完全in vivo，遗传单一，confounder少，研究哪个基因就是哪个基因，没有道德约束，基本想做啥就能做啥，也是目前必用的模型。
  • 现成的细胞系：最简单的验证，一切都可以代工。

模型连用

  • 小鼠 + 类器官 + 细胞系，基本能应对所有的疾病研究。
  • 发育类的疾病就必须要做iPSC了，尤其是我们研究的ENCC，只在发育过程中有，且需要富集才有足够的材料测序。

 

献上一篇cancer model的综述：Cancer models in preclinical research: A chronicle review of advancement in effective cancer research - 2021

 

 

mouse model老鼠模型

简单的就是荧光标记模型，比如 Wnt1-cre;YPF 可以用来标记neural crest，取肠道组织做FACS就可以得到ENCC了。

复杂一点的就是各种transgenic mouse model，比如我们在用的 Kif7 cKO 和 Vcl cKO，就是做了conditional knock-out（必须在指定时空里敲除，不然会直接致死）。

Cre-Lox Conditional KO - YT

通俗解释：核心就是某个特定promoter（tissue，induce、environment-specific）后面跟一个Cre序列（在特定条件下才会翻译出来），另一个就是在目标基因左右的LoxP序列，可以被特异表达出来的Cre蛋白切掉。

我们在用的mutant model：

  • bIII3a-Cre;Ptch1f/f
  • Wnt1-Cre;Sufuf/f
  • Gli3Δ699/Δ699

The f/f designation can also be written as flox/flox. This means that these mice have LoxP sites inserted so that they flank the Gprc6a gene. LoxP sites are recognized by the bacteriophage enzyme Cre recombinase. In research, the Cre Lox technique is a way to selectively “turn off” a gene by excising it from an organism’s DNA, in order to observe the effects. Since many genes are needed for proper embryonic development, you can't just produce a mutant animal with an inactivated version. Cre Lox lets us get around that by leaving the gene intact for development, and allowing us to manipulate it later on.

Without seeing the paper, I can't say for sure what the +/- and -/- are referring to, but they usually indicate the presence or absence of a particular allele or mutation that is under study.

 

 

iPSC诱导性多功能干细胞

 

可以定向分化到特定的组织，然后模拟发育的过程，最厉害的是可以从病人的组织（any mitotic cells）去分化得到，完全模拟病人的状态。

Induced Pluripotent Stem Cell iPSC - YT

Modeling the human brain using induced pluripotent stem cells iPSCs - YT【讲得非常详细，从原理到操作，如何筛选克隆，如何培养类器官】

2006年日本人研发的IPSC技术，获得了诺奖。

PSC多功能干细胞

iPSC诱导而来的PSC（Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc）  

 

 

不要因为自己是搞生信的，就对这些model一点都不在乎，这是你以后吃饭的家伙，实验里面花里胡哨的技能可以不会，但最基本的表型观察，以及取样测序必须会，后面的分析就是咱们的强项。

 

要根据自己的实力来判断使用什么模型！！！

  • 纯新手（没有实验经验，只有一个学生）就用斑马鱼和细胞系，争取能用上小鼠模型，有条件也可以去搞病人的组织，那肯定要搞好医生的关系。 
  • 有3-5年经验的老手，就可以立足小鼠模型，争取上手干细胞和类器官模型，非常烧钱，需要充足的经费和专业人员的支持。

 

发育生物学和细胞生物学的疾病/功能研究的基本套路

基本步骤：

  1. 找一个疾病，比如这里的CCHS，作用：1.联系实际，直接对接临床；2.疾病往往是某一些组件的功能有障碍，遗传疾病则可以直接把（基因-表型-组织/细胞）联系到一起，可以研究的就太多了，先是疾病对应的细胞的功能，以及其中重要分子的调控机制；
  2. 建立动物模型，开始研究，通常先看表型的差异，抗体染色看特定细胞的差异，以及其他核心功能的检测，确定细胞层面的表型；
  3. 深入分子机制的研究，一旦细胞级别的表型确定了，基因测序就可以上了，直接分析是哪些核心的调控因子在起作用，找到潜在的药物靶点；

 

 

参考：2008 – PNAS - A human mutation in Phox2b causes lack of CO2 chemosensitivity, fatal central apnea, and specific loss of parafacial neurons【Phox2b Ala第一篇】

 

 

animal model of CCHS

 

To produce an animal model of CCHS in which to study the anatomical and physiological basis of the disorder, we have introduced into the mouse the most frequent PHOX2B mutation found in CCHS.

As with the human patients, the mutant pups do not respond to hypercapnia, and they die soon after birth from central apnea.

They specifically lack a population of glutamatergic Phox2b-expressing neurons in the RTN/pFRG region.

 

This result strongly supports an essential role of these cells in sensing CO2.

In addition, the mutants have an irregular and slowed-down breathing pattern providing genetic evidence for the importance of the RTN/pFRG neurons for regular breathing at birth.

 

这篇文章结构非常清晰和简单，是非常典型的疾病方向的发育生物学研究，如果测序一做，肯定可以发的更好。

 

 

 

再看一篇：Ciliary protein Kif7 regulates Gli and Ezh2 for initiating the neuronal differentiation of enteric neural crest cells during development

把疾病动物模型应用得炉火纯青

 

从表型开始，确定目标细胞类型；

 

着重关注核心信号通路Hedgehog signaling；

 

通过单细胞技术深入分析了分子机制；

 

posted @ 2022-02-13 16:55  Life·Intelligence  阅读(2120)  评论(0)  编辑  收藏  举报
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