单细胞 RNA 测序（scRNA-Seq）分析一条龙（入门）

工具准备

  1. R语言：Linux下无root权限安装R语言（conda安装和普通安装）
  2. python：conda安装
  3. cellranger：后面用到会说

概述/扫盲

什么是单细胞 RNA 测序（scRNA-Seq）数据？
单细胞 RNA 测序（single-cell RNA seq，scRNA-Seq）是一种用于分析单个细胞中基因表达水平的技术。即可以在单个细胞的水平上检测 RNA 表达。

  • 传统的 RNA 测序（ Bulk RNA-Seq）方法只能测量样本整体的表达水平，而不能反映细胞间的异质性。

单细胞 RNA 测序（scRNA-Seq）数据的预处理流程：

  1. 原始测序结果 FASTQ文件：主要包含多对 核苷酸序列和 质量分数 的FASTQ文件。（核苷酸序列中包含区别不同细胞的信息）（质量分数表明核苷酸序列的可信程度）
  2. 细胞 × 基因表达矩阵 .h5ad/.h5/10x文件：将 FASTQ 文件中的序列与参考基因组进行比对，并计算每个基因在每个细胞中的表达量，生成一个 细胞 × 基因表达矩阵，以便于后续分析。
  3. 质量控制：通过对细胞 ×基因表达矩阵进行质量检查，筛除低质量的数据，例如表达基因量小于50的细胞，提高数据质量。

image
说明： 存储细胞 × 基因表达矩阵的文件有很多种，常用的有.h5ad/.h5/10x/tsv 等等。但是存储原始测序结果的99.99%是FASTQ文件。

从什么地方收集单细胞数据？

  • GEO数据库：存储细胞 × 基因表达矩阵h5ad 文件，
    注意：提交到GEO的数据，大都是进行质量控制后的数据。

  • SRA数据库： 存储原始测序结果FASTQ 文件，

原始测序结果 FASTQ 文件

原始 RNA 测序数据大概率在 FASTQ 文件中。它是一种基于文本的格式，用于存储由单字母代码表示的读序列。 FASTQ 文件中的序列以@符号开头的readID开始，然后是序列数据行，一个简单的加号+分隔符和碱基质量分数。

它以以下格式表示:

@ReadID
READ SEQUENCE
+
SEQUENCING QUALITY SCORES

一般来说，fastq 文件是使用质量控制工具（如 FastQC）进行预处理的。这将输出一系列评估序列 reads 质量的指标。

⚠️但是fastq文件不一定是 单细胞 RNA-Seq

FASTQ 文件是一种通用的测序数据格式，广泛应用于各种类型的测序实验，包括但不限于：

  • 常规的 RNA-Seq（转录组测序）
  • DNA-Seq（基因组测序）
  • ChIP-Seq（染色质免疫沉淀测序）
  • 单细胞 RNA-Seq（如 10x Genomics 平台生成的单细胞测序数据）
  • 全外显子组测序、小片段测序等

下载fastq文件

数据库介绍

代码下载fastq数据

Browsing NCBI with rentrez 使用rentrez访问NCBI数据库

安装Toolkits，使用prefetch下载SRA数据库的fastq数据

细胞 × 基因表达矩阵

一般不会对fastq文件进行分析，需要先通过软件将fastq文件转化为 细胞 × 基因表达矩阵（一般为10x / h5ad文件），一般最常用的是Cell ranger，后面会讲解使用教程。其他工具还有：STARsolo，Doublets等等。

细胞 × 基因表达矩阵 存储方式 介绍与读取

下面几种数据存储的核心数据都是一样的，只是格式不同。

数据读入采取scanpy库进行：scanpy库是用于单细胞数据分析的 Python 库
读取请看：单细胞数据_不同类型的数据介绍与Scanpy读取

.h5ad（anndata 数据格式）

.h5ad数据结构解释（anndata 数据格式）
官方网站：https://anndata.readthedocs.io/en/latest/ ，下面的内容官网都有

h5ad文件提供了一种可扩展的方式来记录数据及其注释 (annotation)，主要包含X, obs, var, uns等多个部分，分别存储不同的信息。结构如下图所示

image
主要由以下几部分构成：

功能 数据类型 说明
adata.X 表达量矩阵 ndarray，scipy sparse，matrix, DataFrame X用来联系obs和var，其中行代表细胞，列代表基因，每个元素的值代表该基因在该细胞中的表达量。
adata.obs 观察值数据 DataFrame,Mapping[str, Iterable[Any]] obs从不同维度描述细胞的信息，不同数据集不同。
adata.var 特征和高可变基因数据 DataFrame,Mapping[str, Iterable[Any]] var从不同维度描述基因的结果，不同数据集不同。
adata.uns 非结构化注释 Mapping[str, Any] 其他注释

.h5 (HDF5)

Hierarchical Data Format (HDF5)文件，HDF5 是一种用于存储和组织大规模科学数据的文件格式。在单细胞数据中，可以使用 HDF5 存储表达矩阵、基因和细胞的元数据等信息。
AnnData的.h5ad文件，是基于 HDF5 的文件格式，参考h5ad即可。
注意：.h5ad和.h5两个读取方式不同

10x_mtx（cell ranger输出，三个文件）

就是cell ranger上游比对分析产生的3个文件：
├── xxx_feature_bc_matrix
│ ├── barcodes.tsv.gz：细胞标签(barcode)
│ ├── features.tsv.gz：基因ID(feature)
│ └── matrix.mtx.gz：表达数据（matrix），该文件包含了一个稀疏矩阵，其中每一行代表一个基因，每一列代表一个细胞，每个元素则表示基因在相应细胞中的表达量

具体文件格式如下：

>barcodes.tsv.gz
AAACCCAAGAAACCCA-1
AAACCCAAGAAAGTCT-1
AAACCCAAGAAATTGC-1
AAACCCAAGAACAAGG-1

============
>features.tsv.gz
ENSG00000243485	MIR1302-2HG	Gene Expression
ENSG00000237613	FAM138A	Gene Expression
ENSG00000186092	OR4F5	Gene Expression
ENSG00000238009	AL627309.1	Gene Expression

============
>matrix.mtx.gz
%%MatrixMarket matrix coordinate integer general
%metadata_json: {"software_version": "Cell Ranger cellranger-8.0.1", "format_version": 2}
36601 643092 12843054
19846 1 1
8208 2 1
31505 3 1
22399 4 1

对于R语言，一般先使用read10X()对这三个文件进行整合，得到行为基因、列为细胞的表达矩阵（为稀疏矩阵dgCMatrix格式，节约内存）；然后再配合CreateSeuratObject()函数创建Seurat对象

tsv/csv/txt/tab（一个文件）

提醒：.gz是一种压缩格式，.gz前的只要是这几个数据类型，就可以使用。

这些文件本质都是txt，文件里面包含了转成10x_mtx 格式的所有信息：
image

  • 第一行是条形码（基因序列）（barcodes.tsv.gz）
  • 第一列是基因（features.tsv.gz）
  • 其余就是0/1矩阵（reads 计数）（matrix.mtx.gz）

分析fastq数据(->10x文件 / h5ad文件)

一般不会对fastq文件进行分析，需要先通过软件将fastq文件转化为10x文件/ h5ad文件，一般常用的是Cell ranger，后面会讲解使用教程。其他工具还有：STARsolo，Doublets。

使用Cell ranger分析单细胞数据

Cell Ranger 是一组分析管道，用于处理 Chromium 单细胞数据以对齐 reads，生成特征条形码矩阵，执行聚类和其他二次分析等等。 它帮助我们生成 RNA reads 计数矩阵，我们将在学习中使用。

注意：只有10x的数据才能用Cell ranger分析，除了10x数据还有其他获取单细胞RNA-seq测序的方式

点击查看广泛应用的scRNA-seq技术汇总

转自：https://shixiangwang.github.io/posts/2023-07-13-fundamentals-of-scrnaseq-analysis

Methods Transcript coverage UMI possibility Strand specific References
Tang method Nearly full-length No No Tang et al. (2009)
Quartz-Seq Full-length No No Sasagawa et al. (2013)
SUPeR-seq Full-length No No X. Fan et al. (2015)
Smart-seq Full-length No No Ramsköld et al. (2012)
Smart-seq2 Full-length No No Picelli et al. (2013)
MATQ-seq Full-length Yes Yes Sheng et al. (2017)
STRT-seq STRT/C1 5′-only Yes Yes Islam et al. (2011)
CEL-seq 3′-only Yes Yes Hashimshony et al. (2012)
CEL-seq2 3′-only Yes Yes Hashimshony et al. (2016)
MARS-seq 3′-only Yes Yes Jaitin et al. (2014)
CytoSeq 3′-only Yes Yes H. C. Fan, Fu, and Fodor (2015)
Drop-seq 3′-only Yes Yes Macosko et al. (2015)
InDrop 3′-only Yes Yes Klein et al. (2015)
Chromium 3′-only Yes Yes Zheng et al. (2017)
SPLiT-seq 3′-only Yes Yes Rosenberg et al. (2018)
sci-RNA-seq 3′-only Yes Yes Cao et al. (2017)
Seq-Well 3′-only Yes Yes Gierahn et al. (2017)
DroNC-seq 3′-only Yes Yes Habib et al. (2017)
Quartz-Seq2 3′-only Yes Yes Sasagawa et al. (2018)

一些概念：

  • GEM 孔（以前称为 GEM 组）：来自单个 10x Chromium™ 芯片通道的分隔单元（凝胶颗粒悬浮液）集合。可以从一个 GEM 孔中获得一个或多个测序文库。
  • 文库（或测序文库）：从单个 GEM 孔中制备的带有 10x 条形码的测序文库。借助特征条形码或 V(D)J 分析，可以从同一个 GEM 孔中创建多个文库。文库类型可能包括基因表达、抗体捕获、CRISPR 引导捕获、TCR 富集等。
  • 测序 Run（或 Flowcell）: A flowcell containing data from one sequencing instrument run.（这个从英文直译上很难理解，通俗的说就是一次上机测序得到的数据流）

详细使用教程： 使用Cell ranger分析单细胞数据

质量控制

常见质量控制指标含义

以h5ad用python处理为例

(1)obs

  • n_genes_by_count：细胞中计数呈阳性的基因数量。（一个细胞中有多少种基因。）

  • total_counts：细胞的计数总数（该细胞的基因总数），这也可能称为库大小。

  • pct_counts_mt：线粒体细胞总数的比例。

(2)var

  • n_cells_by_counts：所有细胞中表达该基因的细胞数目
  • mean_counts：所有细胞中该基因表达的平均值
  • pct_dropout_by_counts：未表达该基因的细胞占细胞总数的百分比
  • total_counts：所有细胞中，基因的表达量总和

Python使用Scanpy计算质量控制指标

请看：scanpy计算n_genes_by_counts和total_counts等质量控制指标

相关教程：

R语言使用Seurat 进行分析

网上有很多，推荐一个：
使用 Seurat 进行分析：
https://shixiangwang.github.io/posts/2023-07-13-fundamentals-of-scrnaseq-analysis/#使用-seurat-进行分析

posted @ 2024-09-24 16:40  kingwzun  阅读(44)  评论(0)  编辑  收藏  举报