安装Toolkits，使用prefetch下载SRA数据库

SRAtool的官方教程：https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/08.-prefetch-and-fasterq-dump

准备

安装Toolkits

建议conda安装，命令如下。(兼容性还行，没必要新建环境)

conda install -c bioconda sra-tools

注意： 使用时记得先激活conda环境。

直接安装，请参考：SRA ToolKit (sra-tools) 的安装和使用

配置prefetch下载路径

prefetch的默认目录是配置Toolkits的路径，非常建议更改下载路径。

1. 如果是conda下载，需要激活相应conda环境；如果是直接安装，cd到sra-toolkit的安装路径下的bin
2. 命令行输入vdb-config -i --interactive-mode textual,会有以下选项

$ vdb-config -i --interactive-mode textual

     vdb-config interactive

  data source

   NCBI SRA: enabled (recommended) (1)


  local workspaces: local file caching: enabled (recommended) (6)

  Open Access Data
cached (recommended) (3)
location: '/mnt/data/xxxxx/xxxxx' (4)

To cancel and exit      : Press <Enter>
To update and continue  : Enter corresponding symbol and Press <Enter>

3. 输入4，回车；
4. 输入新路径（需要保证新路径为空），回车即可

也可以自行通过图形化界面探索其他配置vdb-config -i。（图形界面也可以配置下载路径）

其他配置请参考：三、工具包配置

使用

prefetch下载sra

1. 如果是conda下载，需要激活相应conda环境conda activate env_name；如果是直接安装，直接使用
2. 命令行输入prefetch SRRxxxxxx或者prefetch SRPxxxxx即可下载，下载数据在上面配置路径下的sra目录。

如果想下载到指定文件夹prefetch_dir，下载命令为：prefetch SRRxxxxxx -O prefetch_dir

注意：

1. 该命令不仅可以输入SRRxxxxxx，对于SRPxxxxxx，SRXxxxxxx也是可以的（会下载该ID包含的所有SRR文件）。

2. 下载成功之后会得到SRRxxxx/的文件夹,文件夹内有一个SRRxxxxxxx.sra文件，它就是我们的模板文件，还需要进一步操作，转化成fastq文件才能使用。

3. prefetch自动支持断点续传，若下载过程中，ctrl + c/或其他因素 打断程序运行，重新执行相同的下载命令会在原有基础上下载。

4. 如果是ssh连接服务器，且ssh工具不稳定会断联（ssh断联后，prefetch命令会终止），建议使用后台下载（ssh断开后也会继续下载），后台下载命令nohup prefetch SRXxxxxxx &

prefetch命令的详细介绍如下

prefetch -X 100G -f no -p -o SRRxxxxx.sra SRRxxxxx
# -X|--max-size <size>
#       Maximum file size to download in KB (exclusive). Default: 20G
# -f|--force <yes|no|all|ALL>
#       Force object download: one of: no, yes, all, ALL. 
#       no [default]: skip download if the object if found and complete; 
#       yes: download it even if it is found and is complete; 
#       all: ignore lock files (stale locks or it is being downloaded by another process use at your own risk!);
#       ALL: ignore lock files, restart download from beginning. 
# -p|--progress
#       Show progress.
# -o|--output-file <FILE>
#       Write file to FILE when downloading single file.

🌟提醒： 下载的文件较大可能会提示 prefetch.3.1.1 warn: Maximum file size download limit is 20GB，这时候在原有命令上加上-X 100G即可。

解决lock exists while copying file

断点继续下载可能遇到类似下面的报错：

prefetch.3.1.1 warn: lock exists while copying file - Lock file /mnt/xxxx/data/prefetch_data/sra/SRRxxxxx.sra.lock exists: download canceled

• 如果是下载的SRPxxxxx，则不建议，按照Github的建议加上--force all参数。这样回导致重新下载已经下载好的SRRxxxx.sra文件。建议删除对应的.lock，.prf,.tmp文件，再重新输入之前的命令即可

• 如果是下载的SRRxxxx，则上面两种方案均可。

多文件下载

如果你的info.csv中有许多个文件，都需要下载，如图则下载示例如下

# zsh
for i in `cat ../info.csv | awk -F',' '{print $1}' | sed 1d`
prefetch -X 100G -f no -p -o $i.sra $i
# or
# bash
for i in `cat ../info.csv | awk -F',' '{print $1}' | sed 1d`; do
prefetch -X 100G -f no -p -o $i.sra $i
done

格式转换sra to fastq

常见的 sra to fastq 格式转换工具有三个：fastq-dump, fasterq-dump和 parallel-fastq-dump。性能测试可见：https://zhuanlan.zhihu.com/p/591140275

• fastq-dump官方出品，初代版本，稳定可靠，但是没有多线程，性能极差（缺点：速度极慢）；
• fasterq-dump官方出品，在fastq-dump基础上加入了多线程，提升了数倍性能，但是输出文件不是压缩文件（缺点：不支持压缩）；
• parallel-fastq-dump性能最强，但是输出文件是压缩后的文件，但是非官方出品，兼容性和可靠性有待考证。（缺点：非官方出品）

个人建议用fasterq-dump，对parallel-fastq-dump感兴趣自行搜索

fastq-dump

个人建议用fasterq-dump，而不是fastq-dump，但是fastq-dump支持输出的文件就是gz压缩后的文件，省事省存储，而且兼容性最好，如果fasterq-dump出现问题，再使用fastq-dump补充。

fastq-dump常用命令如下，一般只需要修改输入输出路径即可。

fastq-dump --gzip -O . --split-3 /path_to_sra/SRRxxxxx.sra

# --gzip    直接输出fastq为压缩文件(.fastq.gz)，节省空间，但是会导致运行时间较长
# -O .  指定输出文件的目录为当前目录 (.)。按实际要求修改即可。
# --split-3  参数表示如果是双端测序就自动拆分，如果是单端不受影响。下面有详细讲解
# /path_to_sra/SRRxxxxx.sra 输入文件路径

拆分参数split-XXX

这里讲解一下拆分参数split-XXX，为什么需要拆分参数？
默认情况下fastq-dump不对reads进行拆分, 对于很早之前的单端测序没有出现问题。但是对于双端测序而言，就会把原本的两条reads合并成一个，后续分析必然会出错。

常见的参数有三类，对于一个你不知道到底是单端还是双端的SRA文件，建议一律用--split-3。

• --split-spot: 将双端测序分为两份,但是都放在同一个文件中
• --split-files: 将双端测序分为两份,放在不同的文件,但是对于一方有而一方没有的reads直接丢弃
• --split-3 : 将双端测序分为两份,放在不同的文件,但是对于一方有而一方没有的reads会单独放在一个文件夹里

关于遇到的Rejected 35403447 READS because of filtering out non-biological READS就是因为原来是SE数据,但是用--split-3当作PE数据处理,出现的问题. 看起来好像有问题,但是对后续结果分析没有太多影响。

fasterp-dump解析成fastq

fasterp-dump命令如下，一般只需要调整最下面的sra路径和-O 输出fastq文件的目录。

fasterq-dump \
    -p -e 12 --split-files --include-technical\
    -O . \
    /mnt/data/prefetch_data/sra/SRRxxxxx.sra

#- -p：指定输出文件为 paired-end (双端) 读取。这意味着输入的 SRA 文件包含配对的读段，输出将生成两个 FASTQ 文件，分别对应每对读段中的第一条和第二条。
#- -e 12：指定使用 12 个线程进行并行处理，可以显著加快转换速度，尤其是对于大型 SRA 文件。
#- --split-3/--split-files：分割文件的方式。
#- -O .：指定输出文件的目录为当前目录 (.)。可以自己指定
# xxxx/sra/SRRxxxxxx.sra : 输入的sra文件的目录

注意：

1. 对于为了cellranger分析的数据（即10x数据），必须使用 --split-files / --split-3（split-3未测试，split-files经测试没有问题）和--include-technical参数才能保证输出的文件为三个（如果转化后不为3个，说明转换成sra文件前就不是3个）。
2. fasterq-dump没有--gzip|--bizp2选择，您必须在转化成fastq文件后自己再压缩。
   压缩命令推荐pigz，也是支持多线程，兼容性强的工具，相关命令如下

pigz  -p 8   path_to_fastq/*.fastq
# -p 8：指定使用 8 个线程进行并行处理
# -k：如果加上该参数，意味着不删除压缩前的文件
# path_to_fastq/*.fastq：要压缩的文件路径，只需要更改path_to_fastq即可，不要动*.fastq，会自动分别压缩目录下的所有.fastq文件

⚠️解决fasterq-dump 仅返回双端样本的一个文件

详细原因，请看： fasterq-dump only returns one file for a paired-end sample

原因： 对于一些10x数据，研究者上传的是.bam文件，而SRA和fastq都是通过.bam文件处理得到的，这种情况下使用SRAtoolkit从SRA向fastq转换就不会得到预期的fastq文件。

解决方法：下载原始的.bam文件，然后用bamtofastq工具，将.bam文件转换成fastq文件。

• 下载原始.bam文件，请看：BAM to gene expression matrix (UMI counts per gene per cell),10X

• bamtofastq工具的具体方法，请看：10x单细胞转录组数据bam格式转为fastq格式
  补充教程：10x官网下载pbmc3k的bam文件走定量流程

bamtofastq工具相关信息

1. 下载地址
2. 教程： Converting 10x Genomics BAM Files to FASTQ

使用Cell ranger分析单细胞数据( fastq->10x/h5ad文件)

查看我另一篇文章：使用Cell ranger分析单细胞数据(单细胞分析上游)( fastq->10x文件 / h5ad文件 )

附：基本概念

全球三大核酸序列数据库

SRA（Sequence Read Archive）、ENA（European Nucleotide Archive）和DDBJ（DNA Data Bank of Japan）是全球三大核酸序列数据库，分别由美国国家生物技术信息中心（NCBI）、欧洲生物信息研究所（EMBL-EBI）和日本DNA数据库中心（DDBJ）维护。它们共同收录了全球范围内的核酸测序数据，包括基因组、转录组、宏基因组等。它们之间的数据是实时同步的，所以可以在任意一个数据库中下载数据。

每个数据库的特点（Gemini给出）：

• SRA：由NCBI维护，是世界上最大的核酸序列存档，其中的数据则是通过压缩后以.sra文件格式来保存的，SRA数据库可以用于搜索和展示SRA项目数据，包括SRA主页和 Entrez system。SRA提供了强大的搜索功能，用户可以根据不同的实验条件、物种、测序平台等进行检索。
• ENA：由EMBL-EBI维护，是欧洲主要的核酸序列数据库，界面相对于SRA更友好，对于有数据需求的研究人员来说，ENA数据库最诱人的点应该是可以直接下载fastq (.gz)文件。ENA不仅提供序列数据，还提供丰富的注释信息，例如基因功能、蛋白质结构等。
• DDBJ：由日本DNA数据库中心维护，是亚洲最大的核酸序列数据库。DDBJ主要收录来自日本的核酸序列数据。

总结： EBI数据库界面友好且能够直接下载fq文件。而NCBI则需要先下载sra文件，然后再转换成fq文件，但是使用官方的Toolkits工具也挺易用。
或者可以直接使用sra-explorer，它是一个为了让SRA更易检索、更易下载的网页端应用。

SRA数据库的名词概念

SRA 与 Trace 最大的区别是将实验数据与 metadata（元数据）分离。metadata 是指与测序实验及其实验样品相关的数据，如实验目的、实验设计、测序平台、样本数据(物种，菌株，个体表型等)。metadata可以分为以下几类：

SRP(项目 Project)—>SRS(样本 Sample)—>SRX(数据产生 Experiment)—>SRR(数据本身)

• Study / Project
  accession number 以 DRP，SRP，ERP 开头, 表示的是一个特定目的的研究课题，可以包含多个研究机构和研究类型等。study 包含了项目的所有 metadata，并有一个 NCBI 和 EBI 共同承认的项目编号（universal project id）【以PRJ开头！！】，一个 study 可以包含多个实验（experiment）。
  Submission
  一个 study 的数据，可以分多次递交至 SRA 数据库。比如在一个项目启动前期，就可以把 study，experiment 的数据递交上去，随着项目的进展，逐批递交 run 数据。study 等同于项目，submission 等同于批次的概念。

• Sample
  accession number 以 DRS，SRS，ERS 开头，表示的是样品信息。样本信息可以包括物种信息、菌株(品系) 信息、家系信息、表型数据、临床数据,组织类型等。可以通过Trace来查询。

• Experiment
  accession number 以 DRX，SRX，ERX 开头, 表示一个实验记载的实验设计（Design），实验平台（Platform）和结果处理（processing）三部分信息。实验是 SRA 数据库的最基本单元，一个实验信息可以同时包含多个结果集（run）。

• Run
  accession number 以 DRR，SRR，ERR 开头, 一个 Run 包括测序序列及质量数据。