h5ad文件 )

概述

获取single-cell RNA-Seq数据时有可能获得的是fastq文件，如下展示，fastq文件是单细胞测序的原始文件，如果需要10x文件/h5ad文件，需要通过Cell ranger程序的cellranger-count方法进行处理。

HRR1221999文件夹：
-- HRR1221999_f1.fq.gz
-- HRR1221999_f2.fq.gz
-- HRR1221999_sta.xml

安装Cell Ranger

参考：

下载与解压

进入 cellranger官网注册，获得下载地址
会获得curl的链接，命令行运行即可下载。
（可选）利用md5检验文件完整性

$ md5sum cellranger-8.0.0.tar.gz

cellanger安装：使用tar命令解压完就已经安装完毕。

#解压
tar -zxvf cellranger-8.0.0.tar.gz

配置环境变量

虽然安装完毕，但是现在要运行cellranger的话需要在终端输入cellranger的整个路径。

将cellranger的路径加入$PATH，这样只需要在终端输入cellranger就可以执行命令。

将cellranger加入 $PATH有两种方式，分为临时和永久。

临时加载环境变量

临时环境变量仅临时有用，如果电脑重启后就实效了，得重新加入路径。

方法：将路径加入$PATH：

#export PATH=自己的路径:$PATH
export PATH=/home/xxxx/cellranger-8.0.0:$PATH

现在终端输入cellranger就可以执行命令了。

永久加载环境变量

方法：自动执行这个命令，需要将“export PATH=自己的路径:$PATH”这个命令加入.bashrc文件。

具体步骤：

vim编辑器打开.bashrc文件：vim .bashrc
在.bashrc文件最后加入：export PATH=自己的路径:$PATH
source .bashrc立即生效：source .bashrc

附：Cell Ranger主要功能

Cell ranger 的用于基因表达分析 4 个主要功能：

cellranger mkfastq ：它借鉴了 Illumina 的 bcl2fastq ，可以将一个或多个 lane 中的混样测序样本按照 index 标签生成样本对应的 fastq 文件。
cellranger count ：利用 mkfastq 生成的 fq 文件，进行比对(基于 STAR)、过滤、UMI 计数。利用细胞的 barcode 生成 gene-barcode 矩阵，然后进行样本分群、基因表达分析。
cellranger aggr ：接受 cellranger count 的输出数据，将同一组的不同测序样本的表达矩阵整合在一起，比如 tumor 组原来有 4 个样本，PBMC 组有两个样本，现在可以使用 aggr 生成最后的 tumor 和 PBMC 两个矩阵，并且进行标准化去掉测序深度的影响。
cellranger reanalyze ：接受 cellranger count 或 cellranger aggr 生成的 gene-barcode 矩阵，使用不同的参数进行降维、聚类。

结果主要是包含有细胞信息的 BAM, MEX, CSV, HDF5 和 HTML 文件。

使用cellranger count

准备

修改文件名称

cellranger的输入文件格式是fq格式，并且文件的命名也是有要求，文件命名格式如下：

[Sample Name]_S1_L00[Lane Number]_[Read Type]_001.fastq.gz

Read_Type 是什么：
I1: Sample index read (可选)
R1: Read 1
R2: Read 2

比如说：
简单版本（一般看着就行）：

|-- test_sample1
|   |-- test_sample1_S1_L001_I1_001.fastq.gz
|   |-- test_sample1_S1_L001_I2_001.fastq.gz
|   |-- test_sample1_S1_L001_R1_001.fastq.gz
|   |-- test_sample1_S1_L001_R2_001.fastq.gz

复杂版本：

|-- HFLC5BBXX
    |-- test_sample1
    |   |-- test_sample1_S1_L001_I1_001.fastq.gz
    |   |-- test_sample1_S1_L001_I2_001.fastq.gz
    |   |-- test_sample1_S1_L001_R1_001.fastq.gz
    |   |-- test_sample1_S1_L001_R2_001.fastq.gz
    |   |-- test_sample1_S1_L002_I1_001.fastq.gz
    |   |-- test_sample1_S1_L002_I2_001.fastq.gz
    |   |-- test_sample1_S1_L002_R1_001.fastq.gz
    |   |-- test_sample1_S1_L002_R2_001.fastq.gz
    |   |-- test_sample1_S1_L003_I1_001.fastq.gz
    |   |-- test_sample1_S1_L003_I2_001.fastq.gz
    |   |-- test_sample1_S1_L003_R1_001.fastq.gz
    |   `-- test_sample1_S1_L003_R2_001.fastq.gz
    |-- test_sample2
    |   |-- test_sample2_S2_L001_I1_001.fastq.gz
    |   |-- test_sample2_S2_L001_I2_001.fastq.gz
    |   |-- test_sample2_S2_L001_R1_001.fastq.gz
    |   |-- test_sample2_S2_L001_R2_001.fastq.gz
    |   |-- test_sample2_S2_L002_I1_001.fastq.gz
    |   |-- test_sample2_S2_L002_I2_001.fastq.gz
    |   |-- test_sample2_S2_L002_R1_001.fastq.gz
    |   |-- test_sample2_S2_L002_R2_001.fastq.gz
    |   |-- test_sample2_S2_L003_I1_001.fastq.gz
    |   |-- test_sample2_S2_L003_I2_001.fastq.gz
    |   |-- test_sample2_S2_L003_R1_001.fastq.gz
    |   `-- test_sample2_S2_L003_R2_001.fastq.gz

有疑惑看官方教程吧

下载参考序列目录transcriptome

就是运行是transcriptome参数所需要的文件。官方提供了两个，一个适用于人类，一个适用于小老鼠。

human GRCH38 （大小11G，这个文件不仅有fa和gtf文件，而且star的指引文件都构建好了。而且10x公司针对自己的产品做了部分优化）

wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz

mouse mm10 大于10G大小

curl -O https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-mm10-2020-A.tar.gz

如果是其他物种，该文章提到如何自制。

运行

cellranger count --id=run_count_1kscdatas \ #输出文件夹的名字 
--fastqs=/mnt/home/user.name/yard/run_cellranger_count/scdata_1k_v3_fastqs \ #测序数据的路径
--sample=scdata_1k_v3 \ #指定sample的配套文件前缀 
--transcriptome=/mnt/home/user.name/yard/run_cellranger_count/refdata-gex-GRCh38-2020-A #参考基因组路径

常见选项参数：
--id <ID>：
--fastqs：测序数据目录
--transcriptome：参考序列目录
--no-bam：不生成 bam 文件，节约存储
--nosecondary：不要次优的比对
--r1-length：截取 reads1
--r2-length：截取 reads2
--localcores：CPU 核心数
--localmem：内存大小

⚠️Tips：--id参数不能写绝对路径，因此如果需要输出到指定路径下，需要先通过cd到输出结果路径。

输出结果

.outs
├── analysis【数据分析文件夹】
│   ├── clustering【聚类，图聚类和k-means聚类】
│   ├── diffexp【差异分析】
│   ├── pca【主成分分析线性降维】
│   └── tsne【非线性降维信息】
├── cloupe.cloupe【Loupe Cell Browser 输入文件】
├── filtered_feature_bc_matrix【很重要，Seurat, Monocle的输入文件】
│   ├── barcodes.tsv.gz
│   ├── features.tsv.gz
│   └── matrix.mtx.gz
├── filtered_feature_bc_matrix.h5【过滤掉的barcode信息HDF5 format】
├── metrics_summary.csv【CSV format数据摘要】
├── molecule_info.h5【aggregate的时候会用到的文件】
├── raw_feature_bc_matrix【原始barcode信息】
│   ├── barcodes.tsv.gz
│   ├── features.tsv.gz
│   └── matrix.mtx.gz
├──  possorted_genome_bam.bam【比对文件】
├──  possorted_genome_bam.bam.bai【索引文件】
├── raw_feature_bc_matrix.h5【原始barcode信息HDF5 format】
├── web_summary.html【网页简版报告以及可视化】
└── *_gene_bar.csv_temp【过程文件】

cell ranger count 分析结果文件

文件名字	描述
web_summary.html	网页简版报告以及可视化
metrics_summary.csv	CSV format 数据摘要
possorted_genome_bam.bam	比对排序后的bam文件
possorted_genome_bam.bam.bai	比对排序后的bam文件索引
filtered_gene_bc_matrices	过滤掉的 barcode 信息的结果文件，后面Seurat, Monocle 的输入文件
filtered_gene_bc_matrices_h5.h5	过滤掉的 barcode 信息 HDF5 format
raw_gene_bc_matrices	原始 barcode 信息结果文件夹
raw_gene_bc_matrices_h5.h5	原始 barcode 信息 HDF5 format
analysis	数据分析文件夹，里面包括聚类，差异分析，pca 以及 tsne
molecule_info.h5	cellranger aggr 整合多样本时用到
cloupe.cloupe	Loupe Browser 输入文件

posted @ 2024-06-17 08:54 kingwzun 阅读(1188) 评论(0) 编辑收藏举报

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