SWATH-MS Analysis of FFPE Tissues Identifies Stathmin as a Potential Marker of Endometrial Cancer in Patients Exposed to Tamoxifen
文献名：SWATH-MS Analysis of FFPE Tissues Identifies Stathmin as a
Potential Marker of Endometrial Cancer in Patients Exposed to Tamoxifen
doi: 10.1021/acs.jproteome.0c00064
期刊名：Journal of Proteome Research
作者：Lucia Janacova
通讯作者: Pavel Bouchal
单位：
- 捷克马萨里克大学
一、 概述：
在乳腺癌患者中，一部分病人在经过化疗药物泰莫西芬（ET）的治疗后会发展成子宫内膜癌（EC）。ET型肿瘤与原生的子宫内膜癌（EN）呈现出不同的表型。在本研究中，研究者们想通过蛋白质组学的方法找到两种类型肿瘤特异的蛋白标志物。本研究一共选择了45个石蜡包埋（FFPE）的子宫内膜癌样本以及配对的子宫肌膜组织。并利用SWATH的方法对其进行分析。研究发现，钙磷蛋白（CAPS）在EN型肿瘤中丰度更高。此外，抑微管装配蛋白（STMN1）在ET样本中显著升高，而且该蛋白与病人的生存率显著相关。这些发现证实了ET药物治疗与肿瘤发生之间的关联。而这两个蛋白都是区分不同类型肿瘤的很好的biomarker。
二、 研究背景：
子宫内膜癌是一种常见的妇科恶性肿瘤，而一部分乳腺癌患者经过抗癌药物泰莫西芬（ET）的治疗后会发展为子宫内膜癌（EC）。为了提升癌症病人的治疗效果，大量的研究试图从分子角度来寻找EC诊断、预测或者药效动力学相关的biomarker。传统的蛋白水平的biomarker研究利用的是DDA的方法。而该方法会产生大量的蛋白缺失值，大量的缺失值会影响biomarker的发现。而基因DIA的SWATH技术可以有效地减少缺失值，保证数据的完整性。目前，SWATH技术已经可以应用到石蜡样本中。本研究中，共挑选了15里再ET治疗后发展为EC的石蜡样本，19例原生EC肿瘤样本以及11例癌旁组织样本。在本研究中，分别比较了这些蛋白表达与EC临床数据之间的关联性，包括肿瘤分型、是否发生迁移、肿瘤大小、病人存活率等。并利用免疫组化的方法验证了CAPS和STMN1两个蛋白在EC样本中的表达情况。
三、 实验设计：
四、研究成果：
1、差异丰度分析以及临床相关性分析
研究中，将样本分组进行比较，分别比较了癌症样本和癌旁样本、ET组和EN组、不同肿瘤进程组、是否发生迁移以及临床分型分组。并找到了一些差异蛋白。然后利用相关性分析比较差异蛋白在样本间的关联性。如图1A所示，肿瘤样本与正常样本可以很好地区分开。而在肿瘤进程中（图1B），G1样本间相关性最高，G2逐渐下降，G3最低。在图1C中可以看出，非扩散性肿瘤（I0）的异质性更低。而比较临床分析（图1D）可以看出，type I中肿瘤的异质性更低。从这一结果可以看出，不同分组呈现出不同的样本异质性，说明了蛋白质组样本与临床数据的高度关联性。
Fig1. 差异蛋白样本相关性聚类
2、肿瘤样本和癌旁样本的差异蛋白质组分析
比较34个EC样本和11个癌旁样本，共找到431个上调蛋白和115个下调蛋白。通过对这些蛋白的功能进行分析，发现大部分蛋白与EC肿瘤形成相关。其中CAPS和PKM更是已经确认的EC诊断的biomarker，进一步证明了该方法的有效性。
3、EC和ET组差异蛋白分析
对EN组和ET组的比较分析中，共找了6个在ET组显著上升的蛋白、22个在EN组显著提升的蛋白。其中，与EC形成相关的转录因子HMGA1-2、细胞周期调控蛋白STMN1在ET组显著提升，而与免疫和钙调素相关的蛋白在EN组中上调。GSEA分析进一步发现抑微管装配通路在ET中显著富集。
Fig2. 差异蛋白列表
Fig3. 利用IHC方法对CAPS进行验证
Fig4. 利用IHC方法对STMN1进行验证
4、利用免疫组化（IHC）方法对差异蛋白进行验证
为了进一步验证差异蛋白，本研究采用了免疫组化方法对其中9个蛋白进行验证。其中，CAPS、STMN1蛋白在IHC实验中存在显著差异（图3、图4）。此外，CAPS在肿瘤扩散中也存在显著差异，而在肿瘤进程和肿瘤分型中并无显著差异（图3）。STMN1的差异也主要集中在EN和ET中，在其他分型上无显著差异。通过SWATH和IHC的方法均表明，CAPS和STMN1在EN和ET组中存在显著差异，说明这两个蛋白可以显著区分二者。
5、STMN1生存分析
对CAPS和STMN1两个蛋白的生存分析表明，高丰度的STMN1会导致病人的存活率显著下降。而CAPS在两组中无显著差异。接下来又比较了STMN1在病人复发率（RFS）和不同转移存活率（DMFS）上的差异。高表达的STMN1同样会导致病人较差的RFS和DMFS。
Fig5. 生存分析曲线
结论
本研究第一次将SWATH方法应用到石蜡样本中，并保证了较好的鉴定和定量结果。通过对差异蛋白的分析，找到了区分ET和EN两组类型肿瘤的biomarker，CAPS和STMN1。并结合免疫组化的方法对两个marker进行验证。发现其可以很好地表征两类样本之间的差异。
五、文章评论：
本文在技术上首次利用了SWATH方法对石蜡样本进行分析，并找到了两组肿瘤类型相关的biomarker。证明了这种研究方法的可行性。但数据分析除了biomarker外并未涉及更多的机制研究，在数据挖掘层面比较粗浅。
阅读人：闫克强
