Plasma-derived EV Phosphoproteomics through Chemical Affinity Purification(基于化学亲和纯化方法研究血浆来源胞外囊泡的磷酸化蛋白质组)
文献名:Plasma-derived EV Phosphoproteomics through Chemical Affinity Purification(基于化学亲和纯化方法研究血浆来源胞外囊泡的磷酸化蛋白质组)
期刊名:Journal of proteome research
发表时间:(2020年7月)
IF:4.268
单位:
- 普渡大学
- Tymora分析运营公司
- 东南大学
- 印第安纳大学
物种:人血清
技术:非标定量
一、 概述:
本研究应用了一种新型胞外囊泡(EV)富集产品EVtrap,通过展示其在人血浆囊泡磷酸化蛋白质组的实际表现,显示出其相比传统技术在EV快速富集、高回收率等方面具备优势。将该产品结合高分辨质谱,仅需5µl血浆即可获得2238独特的EV蛋白,以及1ml血浆即可鉴定到约1600种磷酸化蛋白。随后研究展示了该技术在慢性肾病或肾癌患者血浆EV磷酸化蛋白质组的效果。
二、 研究背景:
目前广泛应用的癌症疾病诊断方法很多是具有侵入性的,这在癌症早期筛查上则并不合适,因此液体活组织检查成为早期诊断的一种首选方式。最近,细胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)由于其生物标志物载体的性质和在癌症转移方面的突出作用引起各方极大关注,被认为是极具潜力的疾病检测指标。然而EV的标准化收集仍然存在局限性,需要更快速且可重现的EV富集的廉价方案。本文研究者则推出了一款名为EVtrap的对外泌体表面脂质高亲和力的磁珠,该产品之前在尿液EV富集上表现良好,此次则在血浆样本中测试其蛋白鉴定尤其是磷酸化蛋白鉴定的表现,并与其他富集方法比对以凸显其技术优势,另外通过该技术在肾细胞癌血浆样本的蛋白鉴定表现说明其在疾病诊断中的可行性。
三、 实验设计:
研究材料
- 5例健康人血浆样本
- 5例慢性肾病(chronic kidney disease,CKD)患者血浆样本
- 5例肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)患者血浆样本
实验策略
- 将血浆样本稀释20倍,加入1/2样本体积的EVtrap beads大转盘混匀对各血浆样本进行EV富集30min;
- 富集后用PBS清洗beads,再加入200mM triethylamine孵育10min对EV进行洗脱;样本可用于Western Blot、电镜和粒径分布表征;
- 洗脱EV样本抽干后以研究者之前已发表的为EV蛋白提取制定的PTS提取流程进行EV裂解、还原烷基化、蛋白酶解步骤,并用Top-Tip C18 tips进行除盐;
- 每例样本取99%,使用PolyMAC Phosphopeptide Enrichment Kit进行磷酸化肽段富集以方便磷酸化蛋白质组分析;1%用于蛋白质组学质谱分析;LC-MS采用非标定量SWATH-DIA。
分析策略
- 质谱数据由Proteome Discoverer2.3分析;生物信息分析则使用Perseus software(ver 1.6.1.1)。
四、 研究成果:
- 对EVtrap富集到的EV进行了透射电镜和粒径分布表征。图1A、B展示了EV的电镜图片,展示了外泌体的茶杯状结构;图1C、D是2种不同的粒径分布检测手段Nanoparticle Tracking Analysis(NTA)和Tunable Resistive Pulse Sensing(TPRS),2种检测方式展示了相似的结果——富集样本的颗粒直径分布主要集中在100nm-200nm之间。
图1. EVtrap富集EV电镜及粒径分布表征
- 评估EVtrap beads的初始回收率和与其他富集方法比较。研究者将EVtrap与100Kxg超高速离心法(100K UC)以及其他3种商业富集方法进行了多方面的比较:首先是将各方法相当于5µl健康人血浆富集的EV蛋白样本进行Western Blot分析,抗体选用常规外泌体标志物CD9的一抗对整体EV蛋白量进行评估,实验重复3次,结果如图2所示:Evtrap能够产生7倍于100K UC的信号值,而100K UC法回收率较低,其富集后上清仍能捕获到大量EV;其他方法也未能表现出比EVtrap更好的回收率。
图2. 100K UC、EVtrap和其他3种商业富集方法(membrane filtration超滤、size exclusion chromatography分子筛色谱法和polymer precipitation多聚物沉淀法)Western Blot结果比较
- 血浆EV纯度和可重复性评估。图3A展示了各方法下SDS-PAGE的银染结果,表现出EVtrap法有更低的污染水平和更小的高丰度蛋白影响;图3B则是EVtrap富集法重复了9次的Western Blot结果,表现出良好的可重复性。
图3. 各EV富集方法样本纯度及可重复性比较
- 血浆EV蛋白质组和磷酸化蛋白质组的LC-MS分析。研究者对EVtrap和100K UC2种方法基于1ml血浆各自进行了初步的磷酸化蛋白质组分析,相比于100K UC富集样本鉴定到来自177种磷酸化蛋白的321条磷酸化肽段,EVtrap可以检测到1593种磷酸化蛋白的5570种肽段;随后补充了全蛋白质组的分析结果:100K UC法可以鉴定到3282条肽段对应406种蛋白,而EVtrap可以检测到16266条肽段对应2238种蛋白。图4显示了EVtrap法相比100K UC在鉴定到的EV部分标志蛋白、EV全蛋白和磷酸化蛋白上平均信号强度提高了78倍、69倍和85倍,而血清白蛋白等高丰度蛋白信号强度相比之下仅提高了一倍,显示出EVtrap确实改善了血浆EV全蛋白和磷酸化蛋白的检测。
图4. EVtrap法和100KUC法富集EV蛋白质组和磷酸化蛋白质组LC-MS分析
- CKD和RCC患者血浆样本的EV磷酸化蛋白质组分析。如图5所示,相对于健康样本,RCC样本中鉴定到146个显著变化的磷酸化蛋白和28个显著变化的蛋白,CKD样本发现156个显著变化的磷酸化蛋白和16个显著变化的蛋白;而比较RCC和CKD样本可以发现有44个磷酸化蛋白和10个蛋白有显著差异。其中,有4种蛋白是最有潜力的生物标志物,即心肌病蛋白相关蛋白5(CMYA5)、磷酸化形式的Crk样蛋白(CRKL)、磷酸化LYRIC蛋白(MTDH)和载脂蛋白A-IV(APOA4),显示出与癌症相关通路和肾结石/炎症相关存在联系。
图5. 蛋白定量层次聚类分析
五、文章亮点:
- 本研究介绍了一种新型EV富集产品EVtrap在血浆样本中的具体表现。该产品基于静电相互作用和脂质亲和能力对EV进行富集,并在回收率、样本纯度和可重复性等方面优于其他富集技术;
- 该技术在基于质谱的蛋白质组学方面也有较好表现。样本的EV总蛋白鉴定数和磷酸化蛋白鉴定数都有了明显提升,并显示出其在癌症标志物发现和临床快速检测方面的潜力;
阅读人:王欣然