Rapid and quantitative protein precipitation for proteome analysis by mass spectrometry（快速定量的蛋白质沉淀方法用于质谱蛋白质组学分析）【分享人：张霞】
文献名：Rapid and quantitative protein precipitation
for proteome analysis by mass spectrometry（快速定量的蛋白质沉淀方法用于质谱蛋白质组学分析）
期刊名：J. Proteome Res
发表时间：（2020年5月）
IF：3.534
单位：Department of Chemistry, Dalhousie University, Halifax, Nova Scotia, Canada
物种：酿酒酵母
技术：蛋白质沉淀方法
一、 概述：（用精炼的语言描述文章的整体思路及结果）
本研究选取酿酒酵母、通过不同条件的改变，优化了一套回收率较高、时间较短的蛋白沉淀方法。之后通过蛋白定量，凝胶电泳和LC-MS分析具体研究了分离到的蛋白质的数量和性质。文章中通过对盐浓度，孵育温度，丙酮含量及初始蛋白浓度的调节，具体优化构建一套回收率较高，产量较优，时间较短，提取较稳定的蛋白沉淀方法，即室温下以80%的丙酮，100 mM NaCl，孵育2min，以获得高回收率的蛋白沉淀。为后期蛋白质的质谱分析提供更优质的样品蛋白质。
二、 研究背景：（简要介绍研究进展动态、研究目的和意义）
在质谱分析前需要对蛋白进行提取纯化，目前常用溶剂沉淀方法对蛋白质进行分离纯化，多个研究表明丙酮对蛋白具有很好的沉淀作用，常用来纯化组学分析前的蛋白质，但存在回收率低，不稳定等问题，需要对方法进行优化。其中的关键因素是温度，丙酮浓度，孵育时间，盐浓度以及提取蛋白的浓度及性质。本研究通过对这些条件的调节，根据蛋白回收率和回收时间的统计，在不考虑蛋白质分子量、亲疏水性及等电点等因素下，优化了一套高回收率且沉淀时间较短的沉淀方法。
三、实验设计：
四、研究成果：（重点图表展示）
1、对提取的酿酒酵母采用80%丙酮，<1 mM NaCl 溶液，-20°过夜孵育来沉淀蛋白，回收率极低（3 ± 2%），然而当加入>10 mM NaCl溶液时, 蛋白回收率达到98 ± 4%。同时，实验发现，在离子强度足够大的情况下，室温中蛋白回收率也很高，达到99 ± 2%，如图1A所示。图2B展示了不同孵育时间下，NaCl溶液浓度对回收率的影响，可以看到当NaCl溶液达到一定浓度时，时间的增长并不会显著增加蛋白回收率。图1C是对沉淀后蛋白进行凝胶电泳，上部为不加NaCl盐溶液沉淀的蛋白质，下部为加入20mM NaCl溶液沉淀的蛋白质，可以明显看出NaCl盐溶液对于蛋白质沉淀有显著效果。
图1
2、样品的初始蛋白浓度也是影响沉淀蛋白回收的重要因素。图2的实验结果显示，时间对于高浓度当酵母样品的回收率没有影响，对于低浓度蛋白来说，增长孵育（30分钟）时间也能达到较高的回收率，所以优化的高盐/室温沉淀方法同样适用于稀释为0.01 g/ L的低浓度样品。
图2
3、对不同沉淀条件下得到的蛋白质进行质谱检测，得到如图3结果。图3A和3B分别表示-20 °C和室温下不同沉淀时间下鉴定的蛋白数量，发现主要鉴定到的蛋白质在24h孵育条件下沉淀到的，但2min孵育条件下能沉淀到鉴定蛋白的92%。同时图3C显示，室温80%，100 mM NaCl孵育2min和-20°80%丙酮，100 mM NaCl孵育24h两种沉淀方法所鉴定到的蛋白质有70%以上的重叠。图3D显示了两种沉淀方法蛋白质PSM计数之间的强相关性，进一步说明两种沉淀方法对蛋白质的回收效果相似。
图3
4、此外对不同沉淀方法得到的蛋白质性质进行了分析，如图4所示，两种沉淀方法得到的蛋白质的分子量、等电点和GRAVY分数都无显著性统计差异。
图4
5、通过鉴定蛋白质PSM （肽段谱图匹配）的计数，对蛋白质丰度进行量化，发现高丰度的蛋白质在上清液中被鉴定到的概率更高。如图5所示。
图5
五、文章亮点（结论讨论）：
该研究优化了一套蛋白质高效沉淀方法，即在蛋白溶液中加入80%丙酮和高盐溶液（100 mM NaCl），室温孵育2min，经过多次离心，分别收集上清及沉淀，然后再离心后去掉溶液，风干至颗粒。通过对沉淀蛋白进行定量，凝胶电泳以及质谱分析鉴定，证明了该套方法能够高效分离完整的蛋白质，蛋白回收率高，重现性较好，是一种简单、快速且经济的方法，能广泛应用于蛋白质组学、代谢组学和商业蛋白质加工等方面。
阅读人：张霞
