Systematic comparison of strategies for the enrichment of lysosomes by data independent acquisition 通过DIA技术系统比较各溶酶体富集策略 （解读人：王欣然）
文献名：Systematic comparison of strategies for the enrichment of lysosomes by data
independent acquisition（通过DIA技术系统比较各溶酶体富集策略）
期刊名：Journal of Proteome Research
发表时间：（2020年1月）
IF：4.268
单位：
- 德国波恩大学
- 瑞士Biognosys公司
物种：HEK293细胞
技术：数据非依赖性采集（DIA）
一、 概述：
本研究基于数据非依赖性采集（DIA）技术，比较了4种常见细胞溶酶体富集方法——20,000 x g离心生成富含细胞器的沉淀（OEP）、两步蔗糖密度梯度离心（SDGC）、通过超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIONs）富集，以及使用3xHA标记的溶酶体膜蛋白TMEM192进行免疫沉淀（TMEM-IP）——在溶酶体蛋白质组学上的表现。结果表明，SPIONs和TMEM-IP法优于其他方法，对某些蛋白质的富集程度相对于全细胞裂解物高达118倍。此外，与其他策略相比，研究者实现了鉴定的溶酶体蛋白的增加和蛋白强度的更高重现性，从而实现了无标记定量。
二、 研究背景：
哺乳动物细胞的正常功能取决于持续不断的回收大分子和细胞器，保持恒定周转的能力。参与这一过程的细胞器里溶酶体起核心作用，包含多种水解酶，催化多种物质的降解，因此水解酶功能障碍会导致多种疾病，如溶酶体贮积病（LSD）。过去溶酶体只被认为是纯粹的消化和不参与调节的细胞器，现在逐渐认识到其回收细胞器、主动转运回收产生分子到细胞质参与反应的能力。因此溶酶体蛋白分析逐渐兴起，目前在分子生物学研究中已经定义了约160种真正的溶酶体蛋白，以及约30种溶酶体相关蛋白。
目前常用的富集溶酶体的方法有：亚细胞结构密度梯度离心（SDGC）、将超顺磁性氧化铁纳米颗粒通过细胞无差别内吞作用导入溶酶体（SPIONs）和标签化溶酶体膜蛋白来免疫富集（IP），但是现今仍缺少对这些方法效率的系统性评估。研究者基于蛋白质组学技术集中比较了上述三种富集方法，以及另外一种粗糙的富集方法OEP（达到溶酶体的最完全回收和完整比率）并进行评估。
三、实验设计：
四、研究成果：
1、评估各方法溶酶体产量。研究者通过测定β-己糖胺酶活性（一种溶酶体腔中的酶）来评估溶酶体的完整率和回收率，并规定溶酶体完整性分数等于加入TritonX-100样本酶活（代表溶酶体总数），与不加入TritonX-100样本酶活（代表溶酶体在富集过程中破碎）的差值；由于各方法样本起始量不同，每个样本的PNS（post nuclear supernatant，即富集前粗提液）用TritonX-100处理后的酶活进行归一化。回收率则计算为相对PNS酶活（溶酶体总量），各方法酶活百分比（富集样本酶活/PNS酶活）。
图1 四种富集方法样本及相关组分的归一化β-己糖胺酶活性。I: input; SN: supernatant; FT: flow-through; W: Wash; E: eluate; G1: interphase gradient #1; G2: interphase gradient #2
结果如图1所示，四种方法的溶酶体回收率分别达到了79％（OEP，图1B），7％（SDGC，图1C），47％（SPIONs，图1D）和81％（TMEM-IP，图1E），因此SDGC方法需要一个很高的样本输入量，而OEP方法需求样本起始量最低；各方法样本完整溶酶体比例达到了85％（OEP），80％（SDGC）和85％（SPIONs），TMEM-IP无法计算，因为从beads上洗脱溶酶体需要TritionX-100直接破坏了膜结构，但考虑到富集过程中破碎的溶酶体其β-己糖胺酶难以保持活性，所以推测IP方法溶酶体完整性应该也比较高；另外，分析FT、wash等其他组分可以发现，OEP（几乎无损失）和TMEM-IP（损失11%）方法在富集过程上的损失最少。作者也指出了SDGC和TMEM-IP方法由于细胞密度较高导致溶酶体获得率较其他方法更低。
2、各方法富集溶酶体DIA分析。研究者通过4h的LC-MS / MS DDA运行分析了所有样品以建立谱图库，该库由Spectronaut软件中集成的Pulsar算法生成，涵盖了6966种蛋白质，96,268种肽和122,259种前体，随后，通过2h的HPLC梯度和DIA分析了四种方法样本加细胞全蛋白对照样本，每个方法包含3个生物学重复，之后用Spectronaut软件分析，各方法样本蛋白鉴定数统计如图2A所示；
出于本研究主要目的是分析溶酶体蛋白，研究者对结果进行了GO注释分析（图2B），但这包含了大量基于与其他蛋白质的相似性被注释为溶酶体的蛋白质，研究者因此使用了一个经过验证的178种真实溶酶体蛋白及溶酶体相关蛋白的列表对结果再次过滤（图2C），这使得SPIONs和TMEM-IP这些样本针对性更强的方法的溶酶体蛋白鉴定数较其他方法高出12%左右，通过Overlap比较（图2D-F）也可以看出，这2种方法能够贡献更多的溶酶体蛋白。研究者进一步评估了各方法的可重复性，特别当限定CV<10%，SPIONs仍能表现出较高的溶酶体蛋白鉴定水平。作者由此给出建议：考虑蛋白鉴定数和可重复性，TMEM-IP和SPIONs更好；考虑性价比，OPE更出色。
图2 各方法样本鉴定到的总蛋白(A) , GO功能注释溶酶体蛋白(B)和真实溶酶体蛋白(C) 。
3. 各方法蛋白质群体差异。研究者通过聚类分析和热图（图3A）表现出了数据集的整体的高质量，并通过PCA分析评估蛋白群体差异和相关变量（图3B）。为了进一步分析哪些蛋白导致了各富集方法差异的出现，提取每种蛋白质上样量及对各主要成分（PC1&PC2）中的分离的单独贡献并根据GO注释着色（图3C）。这些分析指出SDGC法线粒体蛋白污染严重，而TMEM-IP和SPIONs方法显示了与其他方法的差异，表现出在溶酶体富集上的优势。
图3 （A）各富集方法及全细胞裂解蛋白样本定量值聚类（B）两种标准主成分PC1和PC2的PCA点图（C）可视化蛋白IDs和GO功能PCA图。
4. 各方法细胞器丰度定量比较。为了进一步研究单个富集方法的效率，研究者基于单个蛋白的非标定量值来量化细胞器富集的程度。如图4，对每种细胞器选取三种标志蛋白并根据其强度进行绘制，其中TMEM-IP和SPIONs方法能够更大程度的富集溶酶体。
图4 （A-G）各富集方法对7种亚细胞结构的3种标志蛋白丰度变化的比较。（H）各方法每种亚细胞结构蛋白在单个样本总蛋白的分布。
5. 富集方法改变溶酶体完整性。溶酶体在富集过程中可能会导致破裂，这会造成数据不能准确反映溶酶体蛋白组成，因此研究者通过绘制每种富集方法相对于细胞裂解物的溶酶体蛋白子集的强度比作图来进一步研究这一点（图5）。首先过滤数据得到70种真实且可比较的溶酶体蛋白，并以OEP/Lysate作为基准，因为OEP得到的溶酶体完整性较高，并用其他三种方法与之比较。与OEP相比，SPIONs（图5B）和TMEM-IP（图5C）都对大多数溶酶体蛋白产生了明显更高程度的富集（高达118倍），但是部分富集蛋白在这两种方法中丰度差别很大（图5D），这些蛋白经过证实与溶酶体腔内蛋白（如Rheb和LAMTOR1）相关，证明TMEM-IP分离溶酶体会导致溶酶体相关蛋白以及腔蛋白的损失。
图5 (A-C)各富集方法均检测到的真实溶酶体蛋白丰度比值(D) SPIONs/TMEM-IP蛋白丰度比值
五、文章亮点
1. 评估了现有的四种不同的溶酶体富集方法的样本完整性、回收率和可重复性，并结合DIA技术进行基于蛋白质组学方面的比较；
2. 指出OEP和SDGC方法难以在溶酶体蛋白鉴定数上有所提高，杂蛋白污染较严重；
3. 证实SPIONs和TMEM-IP可以实现溶酶体的显著富集，非标定量准确性和可重复性上表现良好；
4. 指出TMEM-IP由于方法原理会导致部分溶酶体蛋白损失，且样本产率也较低，而SPIONs样本完整性较好，各方面性价比较为突出。
阅读人：王欣然
