Integrative Analysis of MicroRNAome, Transcriptome, and Proteome during the Limb Regeneration of Cynops orientalis （文献分享一组-翁海玉）
文献名：Integrative Analysis of MicroRNAome, Transcriptome, and Proteome
during the Limb Regeneration of Cynops orientalis（东方蝾螈肢体再生的小RNA组，转录组，蛋白质组综合分析）
期刊名：Journal of Proteome Research
发表时间：（2019年1月4日）
IF：3.950
单位：
- 西北大学生命科学学院组织工程实验室
- 陕西生物技术省级重点实验室
- 教育部西部资源生物学与生物技术重点实验室
- 陕西生态研究院
物种：东方蝾螈肢体
分享人：翁海玉
技术：小RNA组，转录组，蛋白质组综合分析
一、 概述：（用精炼的语言描述文章的整体思路及结果）
为研究小分子RNA (miRNA)对蝾螈肢体再生的影响,在截肢手术后，用Illumina HiSeq 2500同时分析蝾螈肢体再生过程中的miRNA和mRNA，总共鉴定出203个miRNA和4230个mRNA存在差异表达。与之前的研究获得的蛋白质组数据一起构造了差异表达的交互网。GO和KEGG分析结果表明，差异表达miRNA靶点主要针对细胞骨架重构和碳水化合物代谢。采用层次聚类分析方法分析特定阶段的miRNA对靶点的调控并用qRT-PCR方法进行验证。通过双荧光素酶报告基因实验检测miR-223和miR-133a对靶细胞的负调控。综合分析将提供一个强大的工具将提供一个强大的工具来识别mirna的调控机制及其靶点。研究结果可能有利于对蝾螈肢体再生的复杂机制的理解。
研究背景：（简要介绍研究进展动态、研究目的和意义）
蝾螈的肢体具有惊人的再生能力，为研究脊椎动物的再生提供了一个独特的模型。转录组测序和蛋白质组学方法已经鉴定出许多参与蝾螈肢体再生的基因和蛋白质。然而，这些基因的上游调控分子和潜在机制仍然是是模糊的。miRNA是基因表达的重要精细调控因子。尽管miRNA在蝾螈的各种再生模式中发挥着重要的作用，但目前对miRNA在蝾螈肢体再生中的综合研究还很少。Holman等人已经发现了一些参与蝾螈肢体再生的mirna。然而，由于受微阵列方法的限制，对新型mirna的有效目标预测和识别的研究还不够。这一限制阻碍了对mirna复杂调控机制的研究。因此，系统地识别miRNA-target相互作用网络对于理解蝾螈肢体再生的复杂机制至关重要。基于miRNA - mRNA -蛋白表达谱的综合分析为识别一组差异表达(DE) miRNA及其可能的靶通路提供了一种合理的方法。
三、实验设计：
四、研究成果：（重点图表展示）
1、DE miRNAs主要富集在肢体再生的芽基形成过程中(7和14 天)。
2、在大多数情况下，miRNA作为其目标的负调控因子。因此，上调miRNA可以显著降低靶mRNA或蛋白水平，而下调miRNA可以减轻靶mRNA或蛋白的抑制。结合mRNA和蛋白表达数据，提取了mRNA和蛋白表达水平相反表达的54个miRNA对应的19个靶点
3、采用层次聚类分析方法研究了DE miRNAs和靶基因的时间过程表达模式。从生成的热图(图3A)中，将DE和相应的mRNA按时间分为四个主要组。我们将DE和相应的mrna在时间上分为四大类。A组肌球蛋白调控轻链2B (MLRB)、肌动蛋白2 (MYOZ2)、胞质非特异性二肽酶(CNDP2)、新肌动蛋白结合重复蛋白1 (XIRP1)在肢体再生过程中表达下降。在B组中，一组基因在3、7和14天时上调与对照组相比，在30、42天时恢复到基础水平。C组与B组呈负相关的3个基因分别为matrilin-4(MATN4)、胶原蛋白alpha-3 (IX)链(COL9A3)、胶原蛋白alpha-1(II)链(COL2A1)，在3至14天表达量高，在再生后期表达量低。D组组织蛋白酶K (CATK)和羧肽酶Z (CBPZ)基因在再生后期均有明显上调。此外，大多数mirna与相应的靶基因呈负相关。
4、通过随机选择和检测9个mirna(4个上调的，5个下调的)和8个靶mRNA，验证深度测序表达数据。正如所料，qRT-PCR实验验证结果一致。
5、Western blot检测ANXA1和coronin 1A (COR1A)两种靶蛋白的表达水平
6、通过搜索目标mRNA或蛋白负调控的DE miRNAs的数据画维恩图，3、36、40个miRNA分别在创面愈合、囊胚形成、再发育阶段特异表达，差异有统计学意义。并在相应阶段发现了1、14、22个预测目标。
15、miRNA通过与靶mRNA的3 - untranslation region (UTR)结合来微调基因表达。这一过程导致转录降解或翻译抑制。因此，我们聚焦于miR-223，这是表达量最多的miRNA，通过对HEK293细胞进行DLR检测，研究其对靶基因COL9A3的调控作用。生物信息学分析表明COL9A3 3 -UTR具有miR-223的结合位点(图7A)。简而言之，我们构建了包含野生型或突变型COL9A3 3 -UTR的荧光素酶报告质粒。用miR-223模拟物和荧光素酶报告质粒共转染HEK293细胞。DLR检测显示，转染miR-223模拟物的HEK293细胞中，野生型COL9A3 3 -UTR荧光素酶活性降低，突变型COL9A3 3 -UTR荧光素酶活性无明显变化(图7B)。我们还评估了miR-133a对G6PD的负调控作用(图7A和图7C)。因此，我们假设miR-223和miR-133a通过特异性地调控其靶点影响肢体再生的生物活性。
文章亮点（与产品的结合点）：
本研究采用DE miRNAs及其靶基因和蛋白的时间-过程综合分析，全面阐明其在侧肢再生过程中的作用及其相关调控通路。讨论了再生医学的几个方面，为了解再生机制和损伤组织的修复奠定了基础
阅读人：翁海玉
