MIT Molecular Biology 笔记4 DNA相关实验

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教材 Molecular biology of the gene 7th edition  J.D. Watson et. al

DNA复制相关实验

一、

1、聚合酶活力测定 掺入法

膜结合法

　　1）DNA聚合酶以标记的dNTP为底物反应

　　2）分离dNTP

• 硝酸纤维素滤膜（带正电）
• 点样
• 缓冲溶液洗脱dNTP
  • 50mmol·L^-1 NaCl （离子交换的原理？）
  • （2-3molL^-1 才能洗DNA）
• 看DNA上有没有标记核苷酸掺入

　　缺点：不能定量，可以看看提取液有没有聚合酶

电泳分离法

• 变性胶
• 琼脂糖agarose  + NaOH
• 聚丙烯酰胺 + 尿素
• 辅以加热让DNA变性
• 只标记引物
  • 引物延长实验
  • 避免每个核苷酸被标记

 

 2、聚合酶持续合成能力测定

模板竞争分析

• 实验分两组
• 制备两种引物模板接头（PTJ），一种标记，一种不标记
• 每组加入两倍聚合酶
• 加入没标记dNTP + 1000x 没标记PTJ
• 足够时间反应

　　聚合酶从标记PTJ掉落后，很难再结合上标记的PTJ，因为没标记的PTJ有1000倍之多

　　电泳分析标记的合成产物的长度，即可得知酶的持续合成能力

　　

3、解旋酶的测定

assay for helicase

• 本胶应非变性胶
• 如想看到所有DNA 溴乙锭染色
• 为何低盐助变性：高盐高电解质强度，掩盖了DNA双链负电。低盐，负电互斥

assay for helices polarity

用限制酶切段双链部分 

 

4、拓扑异构酶的测定

assay for topoisomerase

supercoil 泳动速度快

 

区分 type1 type2:

• •  kDNA 连环索烃：短膜虫质粒

  • 看relex的速度 1慢 2快 

    

 

5、核小体定位实验

Assay： 定位核小体实验

　　微球菌核酸酶MNase ：双链内切酶，非序列特异

　　　　　　

连接dna的长度会有物种差异，但是盘绕核小体的长度都是一样的 

 

Assay： MNase-seq 可以知道位置

1.深度消化 只剩147bp

2.电泳纯化

3.两端深度测序  ？？

4.沿染色体定位

细胞周期任何时机都可以做此实验 

 

 

 

通过核小体的限制，让复制、转录蛋白结合在正确位置 

 

二、

1、错配修复分析

　　根据限制酶切割位点专一性

 

2、甲基化的检测

 　　如下几种酶对不同甲基化程度位点的切割效率不同