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MIT Molecular Biology 笔记1 DNA的复制，染色体组装

视频  https://www.bilibili.com/video/av7973580?from=search&seid=16993146754254492690

教材 Molecular biology of the gene 7th edition  J.D. Watson et. al

 

DNA的复制，染色体组装

一、Replication Enzymes 复制酶

1、酶结构：

 

  • 手状结构。thumb不动，而finger动。
  • 手掌：①聚合作用。
    • β折叠片层
    • 2个二价金属离子（Mg2+orMn2+）
      • 一个 降低3'-OH与H的亲和力，以利O-进行亲核攻击
      • 一个 稳定焦磷酸

　　　　　　②错配检查：与小沟作用（无序列特异性）。错配时不能结合，并让部分链解开，以进入校对区

　　　　　　③外切酶活性位点

  • 拇指，手指也与结构的固定有关 O-helix
  • 认的是底物位于正确的位点，错配和rNTP(2'-OH碰撞)都不能很好地位于正确位点

 　　

2、dNTP的掺入

　1）dNTP被固定在特定位置（被O-helix压着防止水解）

  • 碱基配对
  • PPP与二价金属阳离子（Mg2+）作用：故金属螯合剂可以让聚合酶失活
  • O helix和的酪氨酸和碱基的π-π相互作用
  • Lys和Arg和磷酸基团的作用

　2）缩合，释放一个焦磷酸，O helix被释放

  • 羟基攻击α磷酸

　3）DNA移位，新的3‘ 位于活性中心

 

3、错配

　　每105bp会有一个错配

　　为何错配：

  • 多为嘌呤-嘌呤，嘧啶-嘧啶间出错
  • 碱基会异构：keto-enol 和 amino-imino

 

 

　　错配会减慢合成速度，在这时，聚合酶的外切活性位点会修复

  • Proofreading exonuclease 外切酶 3’->5‘活性
  • 同一酶的不同活性中心
  • 错配时，将与外切中心亲和力高
  • 这让错误率降低到 1mistake/107bp

 

二、Replication Fork 复制叉（原核为例）

1、聚合酶

  • 聚合酶I                          5'->3'  3'->5'切，  短聚合
  • 聚合酶III为核心酶的 全酶   3'->5'切 ， 长聚合
  • 其他　　　　                  修复

　　

 

2、DNA Primase 引物酶

  • 合成RNA引物
  • 要和helicase结合以提升活性，故只在复制叉处有活性

　　Question 引物酶持续合成能力测定？

3、 DNA helicase 解旋酶

 

　　结合+ATP-->水解-ADP&Pi-->放开

　　　|　　　　　　　　　　　　　|

　　     <-----向前移位--------

  • 结合ATP后返回顶部，发夹结合碱基->随着ATP水解和释放->底部
  • 原核中 环绕后随链
  • 真核中环绕先导链
  • Helicase是双向都能走的

 此时亚基结合了ATP，作用方式类似在DNA上滑动

　　　　　　　　　　　　　　　　　　

结合上ATP 和 水解ATP对结构的影响都很重要

 

assay for helicase

    • 本胶应非变性胶
    • 如想看到所有DNA 溴乙锭染色
    • 为何低盐助变性：高盐高电解质强度，掩盖了DNA双链负电。低盐，负电互斥

 

assay for helices polarity

用限制酶切段双链部分

 

 

 

4、SSB：协同结合的方式，结合ssDNA。与骨架静电作用，与碱基疏水堆积作用。

 

5、Topoisomerase 拓扑酶

　　DNA是10.4bp每一个螺旋的结构

  • type1 ：切一个链，不用ATP，依靠DNA链的能量【环绕数一次±1】
  • type2：【一次±2】
    • 解索烃
    • 在细菌中，gyrase让链unwound以利解旋
    • 在嗜热菌中，anti-gyrase让链overwound，更稳定

         

 

assay for topoisomerase

supercoil 泳动速度快

 

区分 type1 type2:

    •  kDNA 连环索烃：短膜虫质粒

    • 看relex的速度 1慢 2快 

  

 

三、聚合酶的特化 （原核为例）

1、不同的DNA聚合酶 

 2、滑动夹slide clamp

  • 让聚合酶长距离合成而不掉落
  • 完成时，由于聚合酶识别到了尽头的双链，构象变化，从滑动夹解除
  • 然后滑动夹还会参与其他作用蛋白的募集

3、滑动装载器   装卸滑动夹

  • 过程
    • ATP作用下，装载器张开，  装载器与滑动夹结合，滑动夹开环
    • DNA结合
    • ATP水解下， 装载器与滑动夹解离
  • 在有TPJ时， 装载器装载滑动夹
  • 当滑动夹无用时解离
  • 装载器 与 滑动夹的结合蛋白有相同结合位点，故有作用时不会解离

四、复制叉上的合成（原核为例）

长号模型

1、全酶的组成

  • 核心酶 x 3
  • τ蛋白
  • 柔性接头
  • 滑动加载器
  • 滑动夹

 

2、复制叉蛋白的相互作用

  • 聚合酶通过τ亚基与解旋酶相互作用
    • 确保聚合、解旋耦联
  • 引物酶与解旋酶相互作用
    • 激发引物酶活性，调控冈崎片段长度

HOW THE ENZYMES WORK TOGETHER 

1 τ亚基 刺激 解旋酶

2 解旋酶 刺激 引物酶

3 滑动夹 限制聚合酶在DNA上滑动，直到完成

  •  后随链解链后，与SSB结合。引物酶被激活后，在后随链上合成引物
  • 有两个核心酶参与合成后随链
    • 第二个在第一个释放前已经开始合成，释放的聚合酶在τ蛋白的限制下，很快又结合上PTJ，开始新合成 　

3、冈崎片段的切去修补

  • RNase H讲解RNA引物，但不能降解和dNMP结合的那个rNMP 
  • 再用外切酶降解
  • DNA聚合酶填补空隙
  • DNA连接酶连接

trombone model of dna rep  P293

 　　　　

  　　　　　　

五、复制的起始 （原核为例）

1、特定的基因组DNA序列指导DNA复制的起始

2、复制起始的复制子模型

  • replicon ： DNA均从称为复制子的特定位置开始复制 控制复制起始的两个原件
    •    replicator：复制器：指导DNA复制起始的整套DNA顺式作用序列（其中有复制起始点）
    • 　initiator：   起始子：特异识别复制器中一个DNA元件，并且激活复制的起始
      • 依靠ATP的结合与水解调节 核心AAA+ATP基序　

      

 

 

 六、结合和解旋 起始子蛋白对复制起始位点的选择和激活（原核为例）

1、蛋白质-蛋白质 与 蛋白质——DNA相互作用 指导起始过程

  • 复制机器的组装　　
    • 　起始子蛋白结合DNA的特定序列
      • 　　Ecoli 中是 dnaA 结合 9mer ，13mer 是easily unwound序列
    • 　起始子与复制所需的其他蛋白因子相互作用，蛋白因子和蛋白因子相互作用，组装成复制机器

  

 

  •  dnaA结合富含AT的9mer，使得13mer区解链
  • 解旋酶在loader的帮助下，结合上dna。因为loader的抑     制，此时解旋酶没有活性
  • 解旋酶募集引物酶，引物酶合成引物。引物导致loader解离，解旋酶拥有活性。
  • 解旋酶运动，将链上的dnaA除去
  • polyIII 全酶的识别解旋酶和引物模板接头，被引导至特定位点。
  • 全酶在PTJ处组装滑动夹，滑动夹被聚合酶识别，合成。全酶的另外两个聚合酶位于后随链处
  • 解旋酶的作用下，后随链解旋，ssb蛋白包绕
    • 解旋酶和全酶τ亚基耦联行动
  • 引物酶合成冈崎片段的引物。
    • 引物酶受解旋酶刺激，就是，解旋一段，合成一个引物
  • 另外两个后随链聚合酶合成冈崎片段　

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

七、真核细胞的复制起始与延续

1、真核生物与原核生物酶的比较

2、复制的起始--装载解旋酶

 

  • 复制器上装载解旋酶       G1末期
    • ORC募集Cdc6、Cdt1 介导的 装载　　
  • 复制器，起始位点的激活 S 期    
    • CDK，DDK激活解旋酶
  • 两个过程分开，保证了细胞周期中每个染色体复制一次

 

 

 

 

  • 真核起始子识别复制器，结合ATP
  • 进入G1期：
  • ORC结合起始点（结合ATP）
    • Cdc6 结合上ORC（ATP结合）
  • Mcm2-7结合Cdt1
    • 这相当于解旋酶装载器的两部分分开作用，然后再结合起来
  • Cdt1 与 ORC 相互作用，Mcm27——Cdt1 复合体被ORC募集
  • Cdc6水解ATP：Mcm2-7头对头二聚体装载
  • Mcm2-7包绕双链复制起始点，Cdc6与Cdt1释放
  • ORC水解ATP 重新开始一轮循环
    • 同一起始位点可以装载多个解旋酶

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  • 进入S期后，CDK、DDK被激活
  • DDK作用于已装载的解旋酶
  • CDK作用于Sld2、Sld3
    • Sld2、Sld3与Dpb11结合
  • 这些蛋白导致解旋酶激活蛋白Cdc45、GINS与解旋酶结合
  • 形成CMG复合物
    • Cdc45-Mcm2·7-GINS
  • Sld2、Sld3解离，Dpb11解离
  • Mcm2-7复合体破裂成2，并且各自包绕一条单链
  • 三种聚合酶按特定顺序组装
    • DNA Pol ε 与Cdc45，GINS同时结合在起点（解旋前）
    • DNA Pol δ 与 α（引物酶） 要等解旋后才被募集
      • 保证酶结合上了，引物才合成
  • 只有 CMG 与 三种聚合酶成为复制机器，继续起作用
    • Cdc6  Cdt1 等解离或被破坏

 

 

 

 

八、每个细胞周期只有一轮复制的发生

真核细胞中有数以百千记的复制起始位点，但是每个细胞周期只能进行一轮细胞复制，否则会导致染色体断裂等损伤。

1）如果一个潜在复制起始位点在相邻的复制机器来临前，并没有开始复制，那么这个位点就会被失活（复制机器把蛋白去除）；

2）对解旋酶装载和激活的调控：G1装载，S激活。

调控：与CDK活性有关

 

  • G1期CDK活性低：允许装载，不激活
  • S G2 M 期 CDK高，激活，抑制装载
  • 在起始点处完成复制后，复制机器离开，会产生一条新链，暴露出复制器，这回让ORC迅速结合，但是CDK水平高，阻止了Cdc6，Cdt1，ORC的相互作用。

 

 

九、结束复制

1、子代DNA分子的分离需要拓扑异构酶II

  • 环形复制完成如铰链
  • 线性性染色体复制完成后有DNA连接成环和蛋白作用，故也有和环形类似的问题

2、后随链的合成不能合成线性染色体的末端（冈崎片段5'端RNA引物切口）

  •  细菌的解决方法
    • 蛋白质作为末端（通常是酪氨酸提供-OH）
  • 真核生物采用端粒来解决：
    • 端粒，首尾相接，富含TG的序列（5‘TTAGGG3’）
    • 不使用一般聚合酶；使用特殊DNA聚合酶 端粒酶　

 

 

3、端粒酶

  • 组成
    • 蛋白亚基
    • RNA
  • 端粒酶RNA ：TER
    • 1.5拷贝的序列（人 5'-TAACCCTAA-3'）
  • 特性：
    • 反转录酶活性
    • 不需外源模板
    • 不能复制RNA模板以外的序列
    • 延伸性，核苷酸前体，延长3‘端与普通聚合酶类似

 

 

 

 

 

 

 

4、端粒学说

  • 端粒酶延伸3’末端解决末端复制问题

     

  • 端粒结合蛋白调节端粒酶活性 和 端粒长度
    • 酵母中
      • 端粒结合蛋白Rif 1，2是端粒酶弱抑制剂
      • 随着端粒延长，端粒结合蛋白增多，端粒酶活性被抑制　　
      • Cdc 13 是正向激活剂
      • 结合端粒ssDNA，募集端粒酶　　　
    • 人中
      • POT蛋白 抑制作用
  • 端粒结合蛋白保护染色体末端
    • 断裂标记 ？？？？？？
    • 结合蛋白
    • 形成 t 环
      • t环的形成使端粒免受DNA修复酶修复
      • 但也能阻止端粒酶的作用
      • 端粒越短，越难形成t环
      • 这产生对端粒长度的控制

         

 

 

 

 

十、染色体的组装

1、核小体是染色体的结构单位

  • 8个组蛋白核心
  • 核心DNA
    • 1.65圈 147bp
  • 连接DNA
    • 物种差异 20~60bp

2、组蛋白 带正电荷的小分子蛋白质

· 带正电，赖氨酸，精氨酸含量高

　　连接组蛋白

  • H1

　　核心组蛋白

  • H2A H2B
  • H3
  • H4

　　每种核心组蛋白都存在一个保守结构域：组蛋白折叠域

　　组蛋白组装的顺序：

  • H3·H4四聚体与 DNA 结合
  • 2个 H2A·H2B 二聚体在往上结合

　　核心组蛋白有 N 端尾巴

 

 3、许多不依赖于DNA序列的接触介导核心组蛋白与DNA的相互作用

  • 与小沟和磷酸骨架的作用
    • 主要是蛋白质与小沟附件的磷酸骨架氧原子间形成的氢键
    • 与碱基也有小作用
  • 这些作用DNA弯曲驱动力


4、组蛋白N端尾巴可稳定盘绕在八聚体上的DNA

  • 从DNA螺旋之间或两侧伸出尾巴，作用类似于螺丝上的凹槽，指导DNA左手方式盘旋，形成负超螺旋 。

5、盘绕的DNA呈负超螺旋特性

　　有利于复制、转录

  • 真核靠组蛋白： 装配一个核小体 -1.2linking number
  • 原核靠gyrase 促旋酶（需ATP）
  • 嗜热菌有反促旋酶

 6、核小体的组装

  • DNA复制后染色体即开始组装
  • 复制叉将核小体分开后，两个 H3·H4 二聚体随机去到两条子链上，有助于染色质状态的遗传
    • Molecluar Biology of Gene 7th  认为H2A/B 将释放如可溶环境
  • 核小体的组装需要组蛋白伴侣（histone chaperone）
    • CAF-1的机制
    • PCNA是DNA复制时限制聚合酶位置的滑动器 （那个环）
    • PCNA与聚合酶解离后，结合组蛋白伴侣
    • 优先将H3·H4复合体结合上DNA
    • 继续组装步骤  ： 2* H2A/B 招募

　　高盐让核小体崩解 

 

 Assay： 定位核小体实验

　　微球菌核酸酶MNase ：双链内切酶，非序列特异

　　　　　　

连接dna的长度会有物种差异，但是盘绕核小体的长度都是一样的 

 

Assay： MNase-seq 可以知道位置

1.深度消化 只剩147bp

2.电泳纯化

3.两端深度测序  ？？

4.沿染色体定位

细胞周期任何时机都可以做此实验 

 

 

 

通过核小体的限制，让复制、转录蛋白结合在正确位置 

 

 

 

 

 

7、染色体的高级结构

  • 异染色质和常染色质
  • 组蛋白H1与核小体之间的连接DNA结合
  • 核小体束能形成更复杂结构 30nm fiber
    • 螺线管模型
    • 锯齿模型

    • 与连接DNA长度有关

  • 进一步凝聚
    • 核骨架为中心形成的大环
      • 拓扑酶II 保证拓扑学上分离
      • SMC    与凝聚、姐妹染色单体联会有关
  • 组蛋白变构体影响核小体功能
    • 与修复位点识别有关
    • 可能干扰动粒结合

    • 活性位点裸露在外

 

posted on 2018-10-01 16:00  iojafekniewg  阅读(4543)  评论(0)  编辑  收藏  举报

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