空间转录组分析之SpaceRanger

SpaceRanger 下载安装使用

下载安装

当前版本 Space Ranger - 2.0.0 (July 18, 2022), 运行在Linux 系统， 硬件需满足最小硬件要求：

• 8-core Intel or AMD processor (32 cores recommended)
• 64GB RAM (128GB recommended)
• 1TB free disk space
• 64-bit CentOS/RedHat 7.0 or Ubuntu 14.04

通过命令行下载：

wget -O spaceranger-2.0.0.tar.gz "https://cf.10xgenomics.com/releases/spatial-exp/spaceranger-2.0.0.tar.gz?Expires=1667089612&Policy=eyJTdGF0ZW1lbnQiOlt7IlJlc291cmNlIjoiaHR0cHM6Ly9jZi4xMHhnZW5vbWljcy5jb20vcmVsZWFzZXMvc3BhdGlhbC1leHAvc3BhY2VyYW5nZXItMi4wLjAudGFyLmd6IiwiQ29uZGl0aW9uIjp7IkRhdGVMZXNzVGhhbiI6eyJBV1M6RXBvY2hUaW1lIjoxNjY3MDg5NjEyfX19XX0_&Signature=l1k7cx~qkGirv7rLvUMOaR9mi-nVaiIC7wTKERzAg2uBqjnltKENrWHSruin3ACvHXmLgouqbDbqUO-osM3wk1IzVSwqRnESJ6zhG2Oal0~WWKHh-xLQCDE6D56al44qzqQ7f0Z0X8oiNWQnAkiIm1EsY5hNy48~dybVQRpOoF-ehEdJCtzJOhxk1fWaC7jNs-HqOHTCX7hPZvD3J0y4K6yj0zm~NLGxN7fv2LKde~-4QxYSdQownPsZCTRaB1Qyk2vPuL9sUg4RvikkE5sSp-TxgIXkLbGKhlGVhaLfyq7b9kuTaeAhgBOSwRovTa6E1SMhnZkAMUtUAMKxdw42mA__&Key-Pair-Id=APKAI7S6A5RYOXBWRPDA"

要是下载链接失效，可以去官网获取最新下载链接：https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/software/downloads/latest
解压spaceranger-2.0.0.tar.gz

tar -zxvf spaceranger-2.0.0.tar.gz

添加环境变量，打开~/.bashrc 添加下面代码

# ~/software/bioinfo/spaceranger-2.0.0 换成自己的路径
export PATH=~/software/bioinfo/spaceranger-2.0.0:$PATH

保存后,使之立即生效

source ~/.bashrc

该命令用来检查系统是否满足软件运行所需最小配置，检测报告保存在sitecheck.txt文件里。

spaceranger sitecheck > sitecheck.txt

测试是否安装成功

spaceranger testrun --no-internet --id=verify_install

没问题的话,运行完终端应该输出

Waiting 6 seconds for UI to do final refresh.
Pipestance completed successfully!

2022-08-05 12:14:58 Shutting down.
Saving pipestance info to "verify_install/verify_install.mri.tgz"

数据下载

数据基本信息

• 10x Genomics obtained fresh frozen mouse brain tissue (Strain C57BL/6)from BioIVT Asterand.
• Tissue section of 10 µm thickness
• H&E image acquired using a Nikon Ti2-E microscope
• Sequencing Depth: 115,569 read pairs per spot
• Sequencing Coverage: Read 1 - 28 bp (includes 16 bp Spatial Barcode, 12 bp UMI); Read 2 - 120 bp (transcript); i7 sample index - 10 bp; i5 sample index - 10 bp
• Visium Slide: V19L01-041
• Capture Area: C1

数据URL:

https://www.10xgenomics.com/resources/datasets/mouse-brain-section-coronal-1-standard-1-1-0

参考数据

下载小鼠的参考数据

$ wget https://cf.10xgenomics.com/supp/spatial-exp/refdata-gex-mm10-2020-A.tar.gz
$ tar -xzvf refdata-gex-mm10-2020-A.tar.gz

数据下载

下载fastqs文件：

$ wget -c https://s3-us-west-2.amazonaws.com/10x.files/samples/spatial-exp/1.1.0/V1_Adult_Mouse_Brain/V1_Adult_Mouse_Brain_fastqs.tar
$ tar -xvf V1_Adult_Mouse_Brain_fastqs.tar

以及图像文件

$ wget -c https://cf.10xgenomics.com/samples/spatial-exp/1.1.0/V1_Adult_Mouse_Brain/V1_Adult_Mouse_Brain_image.tif

准备好的数据如下：

datasets/
├── V1_Adult_Mouse_Brain_fastqs
└── V1_Adult_Mouse_Brain_image.tif
refdata-gex-mm10-2020-A/
├── fasta
├── genes
├── pickle
├── reference.json
└── star

其中fastq数据由spaceranger mkfastq生成：

$ ll -h datasets/V1_Adult_Mouse_Brain_fastqs | cut -f 5- -d" "
 974M Nov 15  2019 V1_Adult_Mouse_Brain_S5_L001_I1_001.fastq.gz
1020M Nov 15  2019 V1_Adult_Mouse_Brain_S5_L001_I2_001.fastq.gz
 3.0G Nov 15  2019 V1_Adult_Mouse_Brain_S5_L001_R1_001.fastq.gz
 8.6G Nov 15  2019 V1_Adult_Mouse_Brain_S5_L001_R2_001.fastq.gz
 986M Nov 15  2019 V1_Adult_Mouse_Brain_S5_L002_I1_001.fastq.gz
 1.1G Nov 15  2019 V1_Adult_Mouse_Brain_S5_L002_I2_001.fastq.gz
 3.0G Nov 15  2019 V1_Adult_Mouse_Brain_S5_L002_R1_001.fastq.gz
 8.7G Nov 15  2019 V1_Adult_Mouse_Brain_S5_L002_R2_001.fastq.gz

spaceranger mkfastq的输出文件，其命名规则 samplename_S1_L001_R1_001.fastq.gz.

• samplename， 样本名
• S1 ，sample number，以1起始
• L001, flow cell 中的 lane number, 以1起始
• R1, R1 指 read1, R2指 read 2
• 001, 文件命名的最后一部分，总是001.

流程选择

SpaceRanger 分析中，需根据样本类型，物种和成像方式确定合适的pipeline参数设置。

上图是部分pipeline设置选择，完整表格参考：

https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/software/pipelines/latest/using/choosing-pipelines

主要影响Visium Spatial Gene Expression pipeline选择的因素有：

• 样本制作类型，是fresh frozen(FF),还是 formalin fixed paraffin embedded(FFPE), 其中FFPE类型在spaceranger count 计算时需设置--probe-set 来指定species specific probe set reference file
• 成像图片是Brightfield image 还是Fluorescence image, 其中Fluorescence image需要人工通过Loupe Browser进行手动比对处理

Running spaceranger count (FF)

使用spaceranger count pipeline , 该pipeline 以visium slide的显微镜图像（TIFF或JPEG格式）和FastQ文件作为输入来计算fresh frozen (FF) tissue 的空间基因表达， 包含功能有alignment, tissue ， fiducial detection and barcode/UMI counting.

visium slide是Visium spatial gene expression 的关键，slide 上有A1,B1,C1,D1四个捕获区, 每个捕获区域上有4992 spots ，边上为Fiducial frame（下图红色部分）， 四角为Fiducial marker, 用于后续图像比对识别，不同slide会有所不同， 所以才需通过参数--slide指定特定slide序列号。 而每个 spots 根据组织类型，细胞大小， 组织切片厚度可以捕获的细胞数量在 1-10 个。每个spot有其对应坐标信息， 即组织细胞的空间信息。

命令,适用于可以正常上网的机器上运行：

spaceranger count --id="V1_Adult_Mouse_Brain" \
                  --description="Adult Mouse Brain (Coronal)" \
                  --transcriptome=refdata-gex-mm10-2020-A \
                  --fastqs=datasets/V1_Adult_Mouse_Brain_fastqs \
                  --image=datasets/V1_Adult_Mouse_Brain_image.tif \
                  --slide=V19L01-041 \
                  --area=C1 \
                  --localcores=40 \
                  --localmem=128

参数含义：

• -id: 输出文件夹名
• --description：数据描述，会在web_summary.html 呈现
• --transcriptome：参考转录组
• --fastqs：fastqs文件目录
• --image： brightfield image with H&E staining， TIFF或者JPEG格式
• --slide: visium slide serial number
• --area: The capture area, 可以为A1,B1,C1,D1
• --localcores： CPU核数
• --localmem： 最大内存

输出内容

outs 文件夹内 包含了所有pipeline最终运行输出结果

对于输出结果

• 对于输出的单个文件，可以去Understanding Outputs进一步了解
• 可以打开web_summary.html 来了解初步质控，分析数据结果
• 可以在Loupe Brower中打开.cloupe文件进行下一步分析
• 还可使用 Seurat, DropletUtils, Giotto等工具进行分析

参考

Running spaceranger count (FF) -Software -Spatial Gene Expression -Official 10x Genomics Support
bcl2fastq2 Conversion Software v2.20 Software Guide (15051736) (illumina.com)