文献学习-23/1/11

题目：

GAS2 Promotes Cell Proliferation and Invasion and Suppresses Apoptosis in Pediatric T-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia and Activates Wnt/β-Catenin Pathway

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摘要：

目的：本研究旨在探讨GAS2对T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）的影响及其潜在的分子机制。

方法：通过qRT-RCR和Western blot检测正常T淋巴细胞和T-ALL细胞Jurkat和CCRF-CEM中的GAS2表达水平。 MTT法和Transwell法分别检测Jurkat和CCRF-CEM细胞的增殖和侵袭能力。通过流式细胞术测量细胞凋亡和细胞周期。此外，还通过MTT 测定和流式细胞术检测了 Jurkat 和 CCRF-CEM 细胞的化疗敏感性。

结果：GAS2 在 Jurkat 和 CCRF-CEM 细胞中高表达。 GAS2可促进细胞增殖和侵袭，抑制Jurkat和CCRF-CEM细胞凋亡。 GAS2 还促进了 Jurkat 和 CCRF-CEM 细胞中细胞周期从 G0/G1 期到 S 期的变化。此外，GAS2 可降低 Jurkat 和 CCRF-CEM 细胞的化疗敏感性。 GAS2 过表达可促进 ki67、增殖细胞核抗原 (PCNA)、Bcl-2、c-myc、细胞周期蛋白 D1 和 β-连环蛋白的表达水平，而 GAS2 敲低可抑制其表达水平。同时，GAS2过表达可抑制Bax表达。此外，Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV939可抑制c-myc、cyclin D1和β-catenin的表达，而激活剂LiCl可促进其表达。

结论：我们的研究表明，GAS2 可以促进细胞增殖和侵袭，诱导细胞周期，抑制细胞凋亡，并可以激活 T-ALL 细胞中的 Wnt/β-catenin 通路。

材料和方法：

正常 T 淋巴细胞和 T-ALL 细胞系 Jurkat 和 CCRF-CEM（ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国）在 RPMI-1640（Gibco，美国）补充 10% 胎牛血清（Gibco，美国）37°C 下培养在 5% CO² 中。
用于抑制 GAS2（phU6-EGFP-shRNA-GAS2）或用于诱导 GAS2（pUbi-EGFP-GAS2）的慢病毒载体由 GenePharma（中国上海）提供。它们相应的对照载体也来自GenePharma。总之，将5×10⁴个Jurkat和CCRF-CEM细胞分别加入含有慢病毒载体培养基的24孔板过夜，分为NC组（转染阴性对照）、GAS2组（转染pUbi- EGFP-GAS2）、sh-NC 组（转染 pUbi-EGFP 空对照载体）和 sh-GAS2 组（转染 phU6-EGFP-shRNA-GAS2）。此外，GAS2组细胞在10μM XAV939（Wnt/β-catenin通路抑制剂，Tocris Bioscience，USA）处理后为GAS2 + XAV939组。 sh-GAS2组细胞在20 μM LiCl（Wnt/β-连环蛋白通路激活剂，MedChemExpress，美国）处理后为sh-GAS2 + LiCl组。(过表达组加通路抑制剂，敲低组加通路激活剂)
细胞增殖和凋亡测定。转染后，向细胞中加入 20 μL 3-(4, 5-二甲基噻唑-2-基)-2, 5-二苯基四唑溴化物 (MTT, 5 mg /mL, Sigma, USA) 在预定时间, 并获得 495 nm 处的吸光度。对于细胞凋亡，Jurkat 和 CCRF-CEM 细胞在黑暗中用 5 μL Annexin V-FITC 和碘化丙啶 (PI) 染色，并通过流式细胞仪 (FACSCanto™ II, BD Biosciences, CA, USA) 分析细胞凋亡。
通过预涂有 Matrigel（Invitrogen，USA）的 transwell 小室检查细胞侵袭。简而言之，将转染的 Jurkat 和 CCRF-CEM 细胞接种在上室中，并在下室中加入 500 μL 培养基。 24 小时后，固定膜下侧的细胞并使用 0.1% 结晶紫染料（Sigma，美国）染色。最后，在光学显微镜下计数侵袭细胞的数量。
根据制造商的说明（KeyGEN Biotech，江苏，中国）使用细胞周期检测试剂盒检测 Jurkat 和 CCRF-CEM 细胞周期。简而言之，将细胞种植到 6 孔板中，并在 4°C 下用 PI 染色 30 分钟。转染后，使用 FACSCanto™ II 流式细胞仪（BD Biosciences）分析细胞周期。
将 Jurkat 和 CCRF-CEM 细胞添加到 96 孔板中。当细胞贴壁时，向孔中加入长春新碱（VCR，0.5 μg/mL，Sigma，USA）。培养24 h后，每孔加入20 μL MTT，继续孵育4 h。使用酶标仪在 495 nm 处测量光密度 (OD)。根据以下公式计算抑制率（IR，%）：IR（%）=（1-ODMedicine/ODControl）×100%。
使用 TRIZOL 试剂（Invitrogen，美国）从正常 T 淋巴细胞、Jurkat 和 CCRF-CEM 细胞中提取总 RNA。然后，将 RNA 逆转录成 cDNA，并使用 qRT-PCR（Bio-Rad，CA，USA）和 SYBR green qPCR Master Mix（Thermo Scientific，USA）进行测量。用于 qRT-PCR 分析的引物如下：GAS2 F：5'-GCAACCCAGAGAAGTGTGTCT-3'，R：5'-CAGGAGGCTCCACACCAT-3'； β-肌动蛋白 F：5'-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3'，R：5'-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3'。
使用 RIPA 裂解缓冲液（Beyotime，上海，中国）提取蛋白质样品。将具有相同蛋白质量（50 μg/泳道）的蛋白质样品进行 SDS-PAGE，然后转移至 PVDF 膜。用 5% 脱脂牛奶封闭后，将膜与一抗（GAS2, 1:1000, ab175290; ki67, 1:1000, ab92742, Abcam; 增殖细胞核抗原 (PCNA)）在 4°C 下孵育过夜, 1:1000, #13110；Bax, 1:1000, #5023；Bcl-2, 1:1000, #4223；c-myc, 1:1000, #9402；细胞周期蛋白 D1, 1:1000, #2922；β -连环蛋白 (Ser33/37), 1:1000, #2922 和 β-肌动蛋白, 1:2000, #4967, Cell signaling, USA)。随后，使用 HRP 标记的二抗（1:5000，Sigma，USA）在室温下孵育膜 2 h。蛋白质条带用 ECL 系统（Thermo，美国）可视化，然后用 Quantity One 1-D 分析软件（Bio-Rad）进行分析。

结果：

GAS2 的表达在 Jurkat 和 CCRF-CEM 细胞中上调
GAS2促进细胞增殖
GAS2促进细胞周期从G0/G1期转变为S期
GAS2 抑制细胞凋亡
GAS2 促进 Jurkat 和 CCRF-CEM 细胞的细胞侵袭
GAS2 降低 Jurkat 和 CCRF-CEM 细胞的化疗敏感性
GAS2 激活 Wnt/β-连环蛋白通路

讨论：

尽管 T-ALL 的治疗已取得实质性进展，但由于 T-ALL 患者的耐药性和疾病的复发转移，其预后仍然较差。因此，迫切需要寻找新的治疗方法。鉴定新治疗靶点的分子方法。在这里，我们证实 GAS2 可以促进细胞增殖和侵袭，抑制细胞凋亡，并可以激活儿科 T-ALL 细胞中的 Wnt/β-catenin 通路。

GAS2 是一种微管和微丝相关蛋白，GAS2 的异常表达与恶性肿瘤的进展密切相关。此外，GAS2 在慢性粒细胞白血病细胞和白血病细胞中上调。Jurkat 和 CCRF-CEM 细胞相对于正常 T 淋巴细胞，这与之前的研究一致。越来越多的研究表明GAS2在细胞周期、增殖、凋亡和分化等细胞生物学行为中发挥调节作用。Huang 等指出 GAS2 过表达与结直肠癌的细胞增殖、细胞周期和化疗敏感性有关，GAS2 有助于白血病细胞增殖和抑制细胞凋亡。在这项研究中，我们证明 GAS2 可以促进细胞增殖和侵袭，抑制细胞凋亡并降低 Jurkat 和 CCRF-CEM 细胞的化疗敏感性。此外，我们通过检测两种众所周知的增殖标志物（PCNA 和 ki-67 抗原）和凋亡相关蛋白（Bcl-2 和 Bax）的表达进一步证实了这一结果。

Wnt 信号通路在细胞生长和分化的进程中起着至关重要的作用。作为最典型的 Wnt 通路，Wnt/β-catenin 通路在多种肿瘤中发挥着至关重要的调节作用，例如血液系统恶性肿瘤和乳腺癌。越来越多的研究表明，Wnt/β-catenin通路与造血细胞的分化和增殖密切相关。例如，Zhao 等报道 lncRNA-H19 可通过调节 Wnt/β-catenin 通路促进 ALL 细胞增殖并抑制细胞凋亡。 Xin 等表明，Dishevelled-Axin domain-containing 1 可通过调节 Wnt/β-catenin 通路促进急性髓性白血病细胞生长。 Lyu 等人提出 miR-181a-5p 可通过激活 Wnt/β-catenin 通路促进 ALL 细胞增殖。此外，细胞周期蛋白 D1 是细胞周期进程所必需的，在 ALL 细胞中已发现其过度表达，而 c-myc 与多种肿瘤的生存和进展有关。Liu 等人也指出c-myc 和 cyclin D1 通常被认为是 Wnt/β-catenin 通路的下游靶点。在这项研究中，我们发现 GAS2 过表达可以促进 c-myc、cyclin D1 和 β-catenin 的表达水平，而 GAS2 敲低可以抑制它们的表达水平。此外，Wnt/β-catenin 通路抑制剂 XAV939 或激活剂 LiCl 处理可抑制或促进 c-myc、cyclin D1 和 β-catenin 的表达，表明 GAS2 可激活 Jurkat 和 CCRF-CEM 中的 Wnt/β-catenin 通路细胞。

结论：

总之，我们的研究表明 GAS2 的表达在 Jurkat 和 CCRF-CEM 细胞中上调。我们发现GAS2可显着促进T-ALL Jurkat和CCRF-CEM细胞的细胞增殖和侵袭，诱导细胞周期，抑制细胞凋亡，激活Wnt/β-catenin信号通路。我们的研究提供了一种新的GAS2对T-ALL的调控机制，可能为未来T-ALL的治疗提供参考。