慢病毒转染

慢病毒转染悬浮细胞实验方法

1、在2×105/ml悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒，充分混匀。37℃孵育4小时。
2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后(或离心结束后)加入等体积新鲜培养基（无双抗培养基）以稀释polybrene。
3、继续培养3-4天。中间视细胞生长情况可传代或换液。

病毒感染细胞本来效率就较低，一定要注意以下几点：

感染时的培养基尽量少些。
每1ml的培养基中加入5-10ul的Polybrene（储存液浓度为2mg/ml ），可以提高效率约3-5倍。不过病毒感染效率的问题都是相对的，达到自己的研究目的即可。

建立稳转株

方法

建议使用浓度

哺乳动物细胞：1-10 μg/mL，最佳浓度需要预实验来确定。

溶解方法

用蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/mL的母液，0.22 μm滤膜过滤除菌后分装，于-20℃冻存。

嘌呤霉素杀灭曲线的确定（以shRNA转染或者慢病毒转导为例）

嘌呤霉素有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞所处细胞周期位置等有关，确定杀死未转染细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。初次做实验一定要先进行Puromycin梯度筛选预实验，建立杀死曲线（kill curve）。

以5~8×104 cells/孔的密度24孔板铺板，培养过夜。
准备筛选培养基：含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15 μg/mL，至少5个梯度）。
更换新鲜配制的筛选培养基，继续培养，并观察细胞生长情况，每2-3天更换新鲜筛选培养基。
每日观察细胞存活情况，4-6天内有效杀死所有非转染细胞的药物为最低浓度。

慢病毒感染48-72h后（70-80%融合度），将细胞培养于含适当浓度Puromycin的培养液中，筛选至少48h。当对照未转染的细胞加puro组全部死亡时，感染病毒组剩下全部是阳性细胞。

【注】：①当细胞处于分裂活跃期时，抗生素作用最明显。细胞过于密集，抗生素产生的效力会明显下降。细胞密度最好不超过25%。②每日观察细胞生长状态，嘌呤霉素的筛选至少需要48 h，有效浓度嘌呤霉素的筛选周期一般在3-10天。③病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。在做嘌呤霉素筛选时，越高MOI，含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度，调整嘌呤霉素的浓度去筛选转染细胞，但是嘌呤霉素的浓度不能低于杀死曲线的最低有效浓度；

2）加入含有最低浓度的Puromycin培养基扩增细胞，待qPCR检测结果合格后进行冻存。