1）samtools简介
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背景：前面我们讲过sam/bam格式，sam文件虽然是可读的文本文件形式，但是通常是非常大，因此一般会对其压缩来节省磁盘空间，且对于很多软件来说，相比于对sam文件，对bam文件进行处理更加有效。SAMtools 是一款优秀的用以解析、处理sam/bam格式文件的一种软件包工具。其详细的文档可以在其官网里面找到。它主要包含以下功能：
1、格式转换(convert from other alignment formats)
2、排序 ，合并(sort and merge alignments）
3、去除PCR重复( remove PCR duplicate)
4、call SNP和indels( call SNPs and short indel variants)
5、数据提取(data extraction)
6、可视化（show alignments in a text-based viewer)
2）用法和命令
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像许多linux命令一样，SAMtool命令遵循流模型，允许将多个命令组合到数据处理管道中。标准流（stdin，stdout和stderr）， 发送到stdout的数据默认打印到屏幕上，但很容易使用普通的Unix重定向器（>和>>）重定向到另一个文件，或通过管道（|）重定向到另一个命令。
SAMtools 命令的基本用法是： samtools <command> [options]
2.1) view
view命令用来过滤SAM或BAM格式的数据。输入通常是指定为参数的sam或bam文件，但可以是来自任何其他命令的sam或bam数据。 可选功能包括查看原始文件内容、BAM和SAM格式之间进行转换、将数据子集提取到新文件中， 提取读取的顺序得以保留。
-- Viewing
flags explain BAM flags
tview text alignment viewer
view SAM<->BAM<->CRAM conversion
depad convert padded BAM to unpadded BAM
示例：
2.1.1) 将bam文件转化为sam文件,h 参数表示header
samtools view -h RNA-seq.bam >RNA-seq.sam
2.1.2) 将sam文件转化为bam文件,-b 意思使输出使BAM format,-S 意思使输入使SAM，如果@SQ 缺剩， 要写-t
samtools view -bS RNA-seq.sam > sample.bam
2.1.3) 提取某个区间的比对结果（需要索引文件）
samtools view -hb RNA-seq.bam 'chr17:40465680-40465850' >out.bam
2.14）tview命令启动基于ascii的交互式查看器，可用于可视化读取与参考基因组的指定区域。
Usage: samtools tview <aln.bam> [ref.fasta]
2.15）提取比对上的区域
samtools view -h -F 4 -b RNA-seq.bam > aln_only_mapped.bam
2.2）index
index命令创建一个新的索引文件，生成的* .sam.sai或* .bam.bai文件，允许快速查找（已排序）SAM或BAM中的数据。
-- Indexing
dict create a sequence dictionary file
faidx index/extract FASTA
fqidx index/extract FASTQ
index index alignment
示例：
2.2.1）samtools faidx longreads.fa #对fasta建立索引，会生成.fai文件
2.2.2）samtools faidx longreads.fa r1 >r1.fas #建立索引后就可以提取指定的序列，这里提r1
2.2.3）samtools fqidx longreads.fq #对fastq建立索引
2.2.4）samtools index RNA-seq.bam #对比对文件建立索引
2.3)格式转换
-- File operations
collate shuffle and group alignments by name
cat concatenate BAMs
merge merge sorted alignments
mpileup multi-way pileup
sort sort alignment file
split splits a file by read group
quickcheck quickly check if SAM/BAM/CRAM file appears intact
fastq converts a BAM to a FASTQ
fasta converts a BAM to a FASTA
示例
2.3.1）samtools sort -n RNA-seq.bam >RNA-seq_sorted_out.bam #将bam文件进行排序
2.3.2）samtools fastq RNA-seq.bam >RNA-seq.fq #将bam 文件转化为fastq
2.3.3）samtools fasta RNA-seq.bam >RNA-seq.fa #将bam 文件转化为fasta
2.4）编辑
-- Editing
calmd recalculate MD/NM tags and '=' bases
fixmate fix mate information
reheader replace BAM header
targetcut cut fosmid regions (for fosmid pool only)
addreplacerg adds or replaces RG tags
markdup mark duplicates
示例：
2.4.1）samtools markdup RNA-seq.bam RNA-seq. markdup.bam #进行duplicates标记
2.6）统计
-- Statistics
bedcov read depth per BED region
depth compute the depth
flagstat simple stats
idxstats BAM index stats
phase phase heterozygotes
stats generate stats (former bamcheck)
示例：
2.6.1）samtools depth RNA-seq.bam >depth.out #统计depth信息
2.6.2）samtools flagstat RNA-seq.bam >flagstat.out # 统计大致信息
2.6.1）samtools idxstats RNA-seq.bam >out # 统计index信息
3）参考资源
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1）https://en.wikipedia.org/wiki/SAMtools
2）The Sequence Alignment/Map format and SAMtools
3）https://davetang.org/wiki/tiki-index.php?page=SAMTools
4）https://github.com/davetang/learning_bam_file
