1）知识简介
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1.1）测序质量值
首先在了解fastq，fasta之前，了解一下什么是质量值。phred软件在对reads进行base calling的时候会给出每一个碱基的质量值，这个质量值的计算与测序预期错误率相关(estimated probability of error)：
Phred Quality Score Probability of incorrect base call Base call accuracy
10 1 in 10 90 %
20 1 in 100 99 %
30 1 in 1000 99.9 %
40 1 in 10000 99.99 %
50 1 in 100000 99.999 %
除此之外还有solexa标准，即将p换成了p/(1-p),其他完全按照sanger的定义来做。当测序质量很高的情况下两种形式几乎没区别，但低质量的碱基则有区别了(见下图)
Qscore与p之间的关系，其中红线表示Q=-10 log10p标准，黑色实线表示Q=-10 log10p/(1-p)标准。
1.2）ACII码
为了方便储存及可读这些信息，利用可打印的ACII码将这些质量值转化为单字符single characters (or bytes)。ASCII 字符集，最基本的包含了128 个字符。其中前 32 个， 0-31 ，即 0x00-0x1F ，都是不可见字符，这些字符，为控制字符。可见字符为32–126。sanger-fastaq格式用 ASCII 33–126 来表示phred 质量值 0 到93 。举例来说：一般地，碱基质量从0-40，既ASCii码为从 “！”(0+33）到“I”(40+33）。如果某碱基测序出错的概率为0.001，则Q应该为30。则30+33=63，那么63对应的ASCii码为“？”，在第四行中该碱基对应的质量代表值即为“？”。
2）fastq格式
fastq格式是一个文本格式用于贮存生物学序列及其相应质量值(通常是核酸序列的)。为了简介，这些序列以及质量信息使用ASCII字符标示。该格式最初由Sanger开发，目的是将FASTA序列与质量数据放到一起，目前已经成为高通量测序结果的事实标准。通常fastq文件中每一个序列含有4行信息(如下)：
第一行：序列标识，以‘@’开头。格式比较自由，允许添加注释等相关的描述信息，描述信息以空格分开。如示图中描述信息加入了NCBI的另一个ID名称，及长度信息
第二行：表示序列信息，制表符或者空格不允许出现。一般是明确的DNA或者RNA字符，通常是大写，在一些文本文件中，小写或者大小写混杂或者含有gap符号是有特殊含义。
第三行：用于将测序序列和质量值内容分离开来。以‘+’开头，后面是描述信息等，或者什么也不加。如果“+”后面有内容，该内容与第一行“@”后的内容相同；
第四行：表示质量值，每个字符与第二行的碱基一一对应，按照一定规则转换为碱基质量得分，进而反映该碱基的错误率，因此字符数必须和第二行保持一致。对于每个碱基的质量编码标示，不同的软件采用不同的方案 。目前有5种：
1、Sanger，Phred quality score:值的范围从0到93，对应的ASCII码从33到126，但是对于测序数据（raw read data）质量得分通常小于60，序列拼接或者mapping可能用到更大的分数。
2、Solexa/Illumina 1.0, Solexa/Illumina quality score:值的范围从-5到62，对应的ASCII码从59到126，对于测序数据，得分一般在-5到40之间；
3、Illumina 1.3+，Phred quality score:值的范围从0到62对应的ASCII码从64到126，低于测序数据，得分在0到40之间；
4、Illumina 1.5+，Phred quality score:但是0到2作为另外的标示，详见http://solexaqa.sourceforge.net/questions.htm#illumina
5、Illumina 1.8+
不同的标准之间可以相互转化换，感兴趣可以自己查资料，这里不做详细介绍。注意：第二行@字符，第三行+字符，在第四行质量值中会出现，有时也会在行首出现，因此在处理fastq格式的时候要格外的关注。
3）fasta格式
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3.1）fasta格式最初来自FASTA软件包，也是一种文本格式，以单字符( single-letter codes)贮存核酸或者蛋白序列信息，允许在序列前加注释信息。由2部分信息组成：
>gi|5524211|gb|AAD44166.1| cytochrome b [Elephas maximus maximus]
LCLYTHIGRNIYYGSYLYSETWNTGIMLLLITMATAFMGYVLPWGQMSFWGATVITNLFSAIPYIGTNLVEWIWGGFSVDKATLNRFFAFHFILPFTMVALAGV
HLTFLHETGSNNPLGLTSDSDKIPFHPYYTIKDFLGLLILILLLLLLALLSPDMLGDPDNHMPADPLNTPLHIKPEWYFLFAYAILRSVPNKLGGVLALFLSIV
IGLMPFLHTSKHRSMMLRPLSQALFWTLTMDLLTLTWIGSQPVEYPYTIIGQMASILYFSIILAFLPIAGXIENY
第一部分：以>号开始，紧接着序列的标识符 ，注意区分大小写，且不能出现空格，空格表示序列标识符结束； 随后是序列的描述信息。
第二部分：以序列本身信息，使用既定的核苷酸或氨基酸编码符号，大小写都可以。直到遇到下一个>结束。所有来源于NCBI的序列都有一个gi号“gi|gi_identifier”，gi号由数字组成，具有唯一性。一条核酸或者蛋白质改变了，将赋予一个新的gi号（这时序列的接收号可能不变）。gi号后面是序列的标识符，标识符由序列来源标识、序列标识（如接收号、名称等）等几部分组成，他们之间用“|”隔开，如果某项缺失，可以留空但是“|”不能省略。
3.2）fasta格式在拓展的文件命名中，一般会约定俗成，具体见下表格：
| Meaning | Notes | |
|---|---|---|
| fasta | generic fasta | Any generic fasta file. Other extensions can be fas, fa, seq, fsa |
| fna | fasta nucleic acid | Used generically to specify nucleic acids. |
| ffn | FASTA nucleotide of gene regions | Contains coding regions for a genome. |
| faa | fasta amino acid | Contains amino acids. A multiple protein fasta file can have the more specific extension mpfa. |
| frn | FASTA non-coding RNA | Contains non-coding RNA regions for a genome, in DNA alphabet e.g. tRNA, rRNA |
4）习题(fq练习文件已boweti2中的示例文件reads_1.fq)
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4.1) fq文件中的质量值是如何产生的？
4.2) fq的质量在转化成ACII码的时候，为什么不选择前32个？(0-32)
4.3) fq的质量值在转化成ACII码的时候，为什么不从32开始，而是从33开始？
4.4)在统计fq有多少条序列的时候能不能直接grep '@' read_1.fq | wc -l ?为什么？
4.5)在sanger和solexa标准中，测序的错误率与质量值之间的差别在哪里？
4.6)fasta格式起源于什么地方？4.7)fasta文件的命名有没有特殊的含义？
4.8)fasta序列标识符是如何对应来自不同的数据库来源的？
4.9)转换fasta与fasta的软件有哪些？
4.10)fasta中的字母大小写有没有特殊的含义？
4.11) 统计reads_1.fq文件中共有多少条序列信息
4.12）输出所有的reads_1.fq文件中的标识符(即以@开头的那一行)
4.13）计算reads_1.fq 所有的reads中N的总数
4.14）统计reads_1.fq 中测序碱基为Q30的含量
4.15）统计reads_1.fq 中测序碱基质量为所有大于Q20的碱基含量
4.16）将reads_1.fq转为reads_1.fa文件(即将fastq转化为fasta)
4.17）计算reads_1.fa文件中GC数量
4.18）统计文件中reads_1.fa碱基总数
4.19）计算reads_1.fa文件中GC含量百分比
4.20）过滤掉reads_1.fa文件中N含量超过10%的reads,并统计有多少条
5) 参考资源
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The Sanger FASTQ file format for sequences with quality scores, and the Solexa/Illumina FASTQ variants
https://en.wikipedia.org/wiki/FASTQ_format
https://en.wikipedia.org/wiki/FASTA
http://boyun.sh.cn/bio/?p=1901
https://blog.csdn.net/open2open2/article/details/26706969
