【转录组入门】7：差异基因分析

Posted on 2018-07-03 21:47 微凉charles 阅读(9584) 评论(0) 编辑收藏举报

作业要求：

使用R语言，载入表达矩阵，然后设置好分组信息，统一用DEseq2进行差异分析，当然也可以走走edgeR或者limma的voom流程。

基本任务是得到差异分析结果，进阶任务是比较多个差异分析结果的异同点。

【1】安装DESeq2

1 # 下面是在R语言中操作
2 # 载入安装工具
3 > source("http://bioconductor.org/biocLite.R")
4 # 安装包
5 > biocLite("DESeq2")
6 # 载入包
7 > library("DESeq2")

DESeq2对于输入数据的要求：

1.DEseq2要求输入数据是由整数组成的矩阵。

2.DESeq2要求矩阵是没有标准化的。

【2】DESeq2进行差异表达分析

DESeq2分析差异表达基因简单来说只有三步：构建dds矩阵，标准化，以及进行差异分析。

# dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = cts, colData = coldata, design= ~ batch + condition) #~在R里面用于构建公式对象，~左边为因变量，右边为自变量。

# dds <- DESeq(dds) #标准化

# res <- results(dds, contrast=c("condition","treated","control")) #差异分析结果

【3】构建dds矩阵

1 > library(DESeq2)     # 加载包
2 > countData <- raw_count_filter[2:7]     # 中括号中的数量要与condition中数量一致
3 > condition <- factor(c("control","control","control","hypoxia","hypoxia","hypoxia"))
4 > colData <- data.frame(row.names=colnames(countData),condition)
5 # raw_count_filter：是所有样品的count按照gene id融合后生成的矩阵。行为各个基因，列为各个样品，中间为计算reads。

1 # 正式构建dds矩阵
2 > dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData,DataFrame(condition),design=~condition)
3 # 注意，condition前面是波浪线
4 > head(dds)     # 查看一下构建好的矩阵

【4】对原始dds进行标准化

1 > dds2 <- DESeq(dds)     # 对原始dds进行normalize

1 # 查看结果的名称，本次实验中是“intercept”,”condition_akap95_vs_control”
2 > resultsNames(dds2)
3 # 将结果用results()函数来获取，赋值给res变量
4 > res <- results(dds2)
5 # summary一下，看一下结果的概要信息
6 > summary(res)

【5】提取差异分析结果

1 # 获取padj（p值经过多重校验校正后的值）小于0.05，log2FoldChange的绝对值大于1的差异表达基因。
2 > table(res$padj<0.05)     # 取p值小于0.05的结果
3 > res <- res[order(res$padj).]
4 > diff_gene_deseq2 <- subset(res,padj<0.05 & (log2FoldChange > 1 | log2FoldChange < -1))
5 > diff_gene_deseq2 <- row.names(diff_gene_deseq2)
6 > resdata <- merge(as.data.frame(res),as.data.frame(counts(dds2,normalize=TRUE)),by="row.names",sort=FALSE)
7 # 将差异表达分析结果输出到csv文件
8 > write.csv(resdata,"d:/cs_file/r_file/diff_gene_control_vs_hypoxia.csv",row.names=FALSE)

补充：

用edgeR进行基因差异表达分析

 1 # 加载edgeR包
 2 library(edgeR)
 3 ##跟DESeq2一样，导入数据，预处理（用了cpm函数）
 4 exprSet<- read.table(file = "mouse_all_count.txt", sep = "\t", header = TRUE, row.names = 1, stringsAsFactors = FALSE)
 5 group_list <- factor(c(rep("control",2),rep("Akap95",2)))
 6 exprSet <- exprSet[rowSums(cpm(exprSet) > 1) >= 2,]
 7                  
 8 ##设置分组信息，并做TMM标准化
 9 exprSet <- DGEList(counts = exprSet, group = group_list)
10 exprSet <- calcNormFactors(exprSet)
11                  
12 ##使用qCML（quantile-adjusted conditional maximum likelihood）估计离散度（只针对单因素实验设计）
13 exprSet <- estimateCommonDisp(exprSet)
14 exprSet <- estimateTagwiseDisp(exprSet)
15                  
16 ##寻找差异gene(这里的exactTest函数还是基于qCML并且只针对单因素实验设计)，然后按照阈值进行筛选即可
17 et <- exactTest(exprSet)
18 tTag <- topTags(et, n=nrow(exprSet))
19 diff_gene_edgeR <- subset(tTag$table, FDR < 0.05 & (logFC > 1 | logFC < -1))
20 diff_gene_edgeR <- row.names(diff_gene_edgeR)
21 write.csv(tTag$table,file = "control_vs_Akap95_edgeR.csv")

微凉charles

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