Nanopore sensors for nucleic acid analysis 论文阅读笔记

Nanopore sensors for nucleic acid analysis

Bala Murali Venkatesan and Rashid Bashir

用于核酸分析的纳米孔传感器

纳米孔分析技术是使用电压使得分子通过一个在两电极之间的电解液中的纳米孔，监测当单个分子穿过纳米孔时离子电流如何变化的技术。

这个方法允许充电的聚合物（包括单链DNA、双链DNA和RNA）来在亚纳米级别被分析而且不需要标记和放大。最近的发展显示，基于纳米孔的传感器与第三代基因测序技术相比具有竞争性，而且很可能发展为在成本低于1000美元水平上，快速、可靠的人类基因组测序技术。

本文回顾了纳米孔技术在基因测序、遗传学和药物诊断方面的应用。

 

2004年NIH（National Institutes of Health）提出了1000美元测序计划，纳米孔技术被提出来面对这一挑战。

纳米孔技术优点：不用标记、不用放大、单分子水平、高通量。需要很少的反应物容量，低成本、支持长的测序长度。纳米孔的测序原理是模拟库尔特计数器（coulter counter）

构成是：纳米孔在一个绝缘膜上，这个膜将两个充满电解液的池子分开。充电的分子在施加的电势（这个过程类似电泳疗法）的作用下穿过孔，从而改变了过孔的离子电流。

这个电流反应了关于分子的结构和动态运动的有用信息。

 

纳米孔技术在1995年提出，主要思想是当单链DNA穿过孔的时候，剩余的离子电流取决于当时在孔中的核苷酸或者碱基（A、C、G、T）。因此记录随时间变化的离子电流将能分辨在DNA分子中的序列和碱基。使用这个框架，使用生物孔-α溶血素（α-haemolysin

）、耻垢分枝杆菌MspA（Mycobacterium smegmatis porin A ）显示基于纳米的基因测序是可行的。

 

主要挑战是：减少穿孔速度、或者改变穿孔位置使得碱基更容易被识别。提高灵敏度将会需要新的敏感的方式和新的装置结构。

 

生物孔

生物孔插入到双磷脂层中为单分子DNA分析提供一些优势。

（1）生物可产生大量精准到原子水平的生物纳米孔，而半导体工业不能复制。

（2）X-光晶体学可以提供纳米孔在埃米级别的长度信息

（3）已建立的遗传技术（尤其是定向诱变技术）可用来裁剪纳米的物理和化学属性。

（4）生物孔就尺寸和成分来说具有可观察到的显著的异质性。

在体外研究生物纳米孔的DNA运输通过，一般涉及到七聚物α-溶血素的蛋白质。

前厅（Vesibule）3.6nm的直径。连着一个β-桶装（β-barrel）结构，小于2.6nm宽，小于5nm长。而在两个通道的连接处只有1.4nm宽。

这意味着单链DNA（ssDNA）可以通过纳米孔，而双链DNA（dsDNA）不能。

ssDNA的过孔速度在典型的实验条件下非常快（预计小于1核苷酸/每微秒），这意味着小于100个离子数量在纳米孔中被正确检测。因此，不同核苷酸的出现微小的离子流变化很容易被热扰动（统计变化的电荷载流子的数目和孔中的核苷酸位置）所淹没。

 

大多数的纳米孔测序策略到目前为止试图主动或被动地在读出之前减缓ssDNA运输。积极的方法通常包括酶调节DNA运输通过孔的速度。

 

一种酶电极耦合到纳米孔的吸引原因主要有2点：

（1）     酶的DNA复合物形式是块状–本体溶液，使其达到电泳捕获在纳米孔；

（2）     相对缓慢和有控制的运动被观察到。当酶的DNA分子通过纳米孔。

类似一个碱基一个碱基通过的齿轮效应的ssDNA通过被DNA聚合酶催化的α-溶血素的蛋白质。

最近报道的就是使用phi29 DNA聚合酶在前进的层叠的ssDNA在α-溶血素的蛋白质。

更简单的，减缓DNA的被动方法，也如：核苷酸标记，终止端的单链DNA作为DNA发夹，使用带正电荷的残基在纳米孔的分子中“刹车”，但都需要进一步的工作。

一种更加多用途的方法，使用电阻电流测量法持续解决固有的单核苷酸（dnMP）。

基本的选择性的实现是通过修改一个突变体的α-溶血素孔，将β-桶上通过共价连接在氨基化的环糊精适配器上。

牛津纳米孔公司正在基于这一技术开发。

除了α溶血素，还有其他更有效的生物纳米孔在新兴。一个结构的缺点是：溶血素α的圆柱β桶可容纳~ 10个核苷酸在同一个时间，所有这一切都改变着孔电流：这会稀释单个核苷酸分子在1.4 nm的离子的信号，从而减少测序应用的整体信噪比。八聚体蛋白通道MSPA不存在这个问题，因为它有一个通道的形状像一个锥形漏斗，只是~ 0.5纳米长，在其符合前庭点收缩~直径1.2 nm。

 

生物纳米孔除了基因测序还有其他很多作用。

 从噬菌体phi29 DNA包装马达接头蛋白，例如，可能证明是有用的应用在分子诊断和DNA指纹图谱。

通过基因工程的连接通道嵌入在脂质双层双链DNA的易位是最近展示了。通过这一渠道的dsDNA单向传输（从入口到出口的氨基末端的羧基端）也被观察到，这表明渠道，协助dsDNA包装噬菌体phi29病毒成熟过程中的一个自然的阀机构。这种蛋白的纳米孔的能力将变得更加明显，在未来的几年。

尽管异质性与生物纳米孔显著的敏感性，他们也有一些固有的缺点：支持的纳米孔的脂质双层膜的机械稳定性；生物纳米孔的实验条件的敏感性（如pH值，温度和盐浓度）；且很难整合生物系统为大型阵列。

双层膜的稳定性可以通过固体和多孔基质支持改进。我们将在下一节中看到，固态纳米孔是相当强大的，持久的。

 

固体孔

固态的纳米孔是迅速成为生物纳米孔的一种廉价的和高度灵活的选择。以及鲁棒性和耐久性，固体的方法提供了调整与亚纳米尺寸的精度能力制造的纳米孔的高密度阵列，优越的机械的纳米孔的尺寸和形状的能力，化学和热特性与脂质为基础的系统相比，并结合电子或光学读出技术的可能性。

脱氧核糖核酸在2001年初的时候，戈洛夫琴科和同事使用了一个定制的离子束雕刻工具与反馈控制与薄膜纳米孔的出现使罪定义尺寸的固态纳米孔检测的第一次报告。现在，大多数群体更喜欢用聚焦电子束探针是直径为几纳米的纳米孔中溅射的薄绝缘膜，已经发展了一种技术，自20世纪80年代。

TEM images：透射电子显微镜（英语：Transmission electron microscope，缩写TEM），简称透射电镜，是把经加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上，电子与样品中的原子碰撞而改变方向，从而产生立体角散射。散射角的大小与样品的密度、厚度相关，因此可以形成明暗不同的影像。通常，透射电子显微镜的分辨率为0.1～0.2nm，放大倍数为几万～百万倍，用于观察超微结构，即小于0.2微米、光学显微镜下无法看清的结构，又称“亚显微结构”。

 DNA分析固态纳米孔结构：

Al2O3、纳米悬浮石墨烯薄膜：在石墨烯薄膜含有~ 10单层碳原子形成一个阶梯孔的TEM图像。

纳米孔其他应用：miRNA检测和基因组分析。

探针特异性杂交用于分离和浓缩从组织样本序列特异性miRNAs；基于纳米孔传感器是用来测量miRNAs的水平。这种技术提供了可比的敏感性，传统的微阵列技术。