单细胞测序学习（二）

三、单细胞测序原理

  今天主要介绍单细胞测序原理。10X Genomics和BD Rhapsody是目前单细胞测序的两大主流平台，所以今天的单细胞测序原理介绍也是基于这两个平台的。

　（1）10X Genomics单细胞测序原理

　　

　　

　　上图是10X单细胞测序的原理图。首先要说明的是，单细胞测序和Bulk RNA-seq测序的区别，并不是测序本身的区别，它们同样是基于二代测序技术进行的测序，它们的区别主要是体现在前期对细胞的处理上。
  我们从上图可以看出，10X的单细胞测序需要经过一个双十字系统，经过这个系统才能达到单细胞水平的捕获。在图最左边是带有标记的凝胶微珠，在这个系统中凝胶微珠沿着横向通道向右流动。在第一个十字交叉的地方，放进去细胞悬液和酶，这里的细胞是提前制备的单细胞的悬液。在第一个十字位置，凝胶微珠和细胞及相关酶相遇，一起向右流动。在第二个十字位置，与油相遇，形成一个个包裹着凝胶微珠和细胞的油珠，一起到右边的位置，被收集起来。这样一个细胞和一个凝胶微珠在一起，并处在独立的空间内。
  当这样包裹一个细胞和一个凝胶微珠的油珠被收集之后，细胞就会在酶的作用下破裂，释放出细胞内的RNA，这些RNA就会连接到凝胶微珠上。那为什么释放出来的RNA会连接到凝胶微珠上呢？我们看下边这个图。

　　

　　原来在凝胶微珠表面覆盖了一层短的核酸序列，这些短的核酸序列都是由4部分构成：R1、10X Barcode、UMI和Poly(dT)VN。其中Poly(dT)VN部分是富集T（胸腺嘧啶）的序列，我们知道在RNA的3'末端有一个polyA的尾巴，所以当RNA被释放出来的时候，它的polyA尾巴刚好和凝胶微珠上的poly(dT)VN序列结合，一个RNA连接到凝胶微珠上的一个序列。

　　

　　当拿到带有RNA的凝胶微珠之后，就可以在反转录酶的作用下生成cDNA，然后就是cDNA的扩增，就和Bulk RNA-seq里的扩增一样了。

　　

　　刚才我们看到扩增之后大致形成了如上图所示的序列，那这些序列都是什么呢？其中两端蓝色和黄色的P5和P7，是为了测序而加上的，它们更够和测序芯片上的寡聚核苷酸链进行互补结合；黑色的部分，Read1和Read2是测序引物；中间灰色的横线即要检测的核酸序列；Sample Index是加进去的样本ID，因为虽然建库的时候是分开的，但是测序的时候是多个样本一起的，所以加进去样本ID以作区分；剩下的绿色部分10X Barcode和红色部分UMI是关键部分。每个凝胶微珠上只携带一种10X Barcode序列，即一个凝胶微珠上所有序列的Barcode部分都是序列相同的，它的作用是标记细胞，即测序完成后如何区分哪些序列属于一个细胞的呢，就是看它们的Barcode部分是不是一样的；UMI的全称是Unique Molecular Index，它的作用是为了对RNA的绝对表达水平进行计数。细胞破裂后一个RNA分子会和凝胶微珠上的一个短核酸序列相结合，所以当我们比对确定RNA属于哪个基因后，只需要把来自相同基因的RNA聚到一起，统计一下UMI的种类数就行了。注意，这里是UMI的种类数，不是UMI的个数。以下图为例：

　　

　　以这个图为例，我们把相同基因对应的序列放在一起，我们可以看到它们都带有一样的绿色的部分，那个部分就是10X Barcode部分，这些序列来着同一个细胞，所以它们具有相同的Barcode。挨着Barcode往右一点就是UMI部分，可以看到Gene1有两种UMI，每种两个；Gene2有3种UMI，第一种3个、第二种1个、第三种1个、Gene3000有1种UMI，有3个。因此我们就可以知道，Gene1表达量为2，Gene2表达量为3，Gene3表达量为1，即它们的UMI去重后的个数。也可以看出虽然它们处在相同的扩增环境下，但是它们的扩增倍数并不相同，这个就是PCR扩增的偏好性。因为单细胞测序计算的是UMI的种类数，所以它避免了扩增偏好性的问题。以上就是10X Genomics单细胞测序的原理。

　　

　　BD单细胞测序的扩增和测序部分和10X是一样的，它们的区别主要在于捕获单细胞的部分。

　　

　　如上图所示，这是BD捕获单细胞的方法。首先它使用的不是双十字系统，而是蜂巢板，一个一个孔，好像蜂巢一样。每个孔的大小比一个细胞稍微大一些，可以同时放下一个细胞和一个凝胶微珠。它的操作是首先把细胞悬液倒在蜂巢板上，静置，使细胞在重力作用下进入蜂巢孔（所以它的单细胞捕获要比10X的慢），然后在蜂巢板上加上凝胶微珠，等凝胶微珠也落到蜂巢孔里和细胞结合，然后洗去多余的凝胶微珠，从而达到单细胞捕获的目的。
  但是这样的操作会不会有的蜂巢孔是空的，而有的进去两个细胞呢？当然是会的，想要每个孔里刚好都有一个凝胶微珠和一个细胞是很难的，但是只要这部分的比例不用太大就行。所以在它的仪器上会有如下的统计展示。在这个展示里会统计单细胞捕获的具体情况，当右侧这些统计的指标都是PASS的时候，就说明此次单细胞捕获是合格的，可以进行后续的操作了。当细胞捕获后，它的后续部分原理和10X就一样了。

　　

　　下图是10X和BD的一个对比。