单细胞测序学习（一）

一、单细胞测序简介

　　单细胞测序技术（single cell sequencing）是指在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析的一项新技术，它能够弥补传统高通量测序的局限性，揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性。
  我们经常看到的scRNA-seq其实就是single cell RNA-seq的缩写，即单细胞RNA测序，或叫单细胞转录组测序。

　　

　　上图为单细胞发展的过程，横坐标为时间轴，纵坐标为单次研究中的细胞数。可以看出单细胞测序从2009年开始发展，起初也只能检测一个细胞，到目前已经能检测上万细胞，并且中间也不断出现一些新的技术。

二、单细胞测序优势

　　(1)解决样本量太少无法进行常规测序的问题

　　(2)解决细胞间异质性问题

　　(3)避免PCR扩增偏好性问题

　　关于单细胞测序的这三个优势，其中第二个提到的比较多，大部分关于单细胞测序的介绍都会提到。第一点很好理解，所以这里也只介绍一下第二点和第三点。
  单细胞测序解决细胞间异质性的问题，也是单细胞的主要优势，因为它是基于单细胞水平的测序，所以它相对于之前的bulk RNA-seq，它能捕获每个细胞内的基因表达情况，而不只是一块组织或一个血样所有细胞内基因的平均值。

　　

　　我们看上边这个图，在这三组细胞中，他们分别是10%的强阳性，50%的中阳性和100%的弱阳性。很明显这三组细胞是不一样的，但是如果我们只看它们的平均值的话，很明显它们的平均水平却是很相近的。以一个极端的例子来看，假设强阳性为100，中阳性为20，弱阳性为10，那很明显这三组的平均值就都是10，那么按检测的或我们就会得出三组样本是完全一样的结论，那显然是错了！
  但是单细胞测序是基于细胞水平的测序，即它是对每个细胞内的基因表达情况进行测定，那在单细胞测序的检测下，我们就可以得到第一组10%强阳性，第二组50%中阳性和第三组100%弱阳性的结论。这就是单细胞测序解决细胞间异质性的问题。

　　

　　这个图依然可以说明上述问题，Bulk RNA-seq它是把所有细胞都混在一起直接测定的，所以它只能获得所有细胞内基因的平均值，对于获得的任何一个基因的表达值，都是在所有细胞的均值。而单细胞测序是首先把每个细胞进行一个分离，从而捕获每个细胞的表达情况，它是获得了每个基因在每个细胞内的表达情况，所以它的下游可以进行更加精细的分析。
  关于第三点优势，单细胞测序避免PCR扩增偏好性的问题。我们知道很多情况下的测序都是需要进行PCR扩增的，但是扩增有一个问题，就是在扩增的时候不同核酸序列在同样的条件下扩增程度是不一样的。有些核酸序列容易被扩增，有些核酸序列不容易被扩增，导致在同样时间同样条件下可能获得不一样的扩增倍数，所以扩增后的核酸序列丰度与扩增前是有一定的差异的。单细胞测序能够避免PCR扩增偏好性，并不是在扩增本身有了技术变革，而是因为它所计算的不是扩增后的核酸序列的相对丰度，而是计算了扩增前核酸序列的实际数值。这一点到后边原理部分会有更清楚的体现。